抗病毒感染育种
动物抗病毒育种包括两个方面的内容：一是应用常规育种技术，筛选自然存在的 抗病个体或 品系，通过有计划的选配和选育，培育一些抗病毒动物新品系；二是采用基因工程手段，即 是利用DNA重组技术，克隆和构建抗病毒基因，并通过转基因手段导入动物种系染色体内 ，构建转基因动物，再结合常规育种技术，培育抗病毒动物新品系。[BT3](一) 常 规抗病毒感染育 种常规抗病毒育种技术已在家禽实践上取得了一定的成功。鸡马立克氏病(MD) 是鸡最常见的淋巴 组织增生性疾病，本世纪三十年代在全世界养鸡地区广泛流行，危害严重，随后有所平熄。 到了六十年代初，强毒力的马立克氏病病毒再度出现并广泛流行。分析马立克氏病流行特点 后发现，鸡体的遗传结构与马立克氏病的易感性密切相关，在遗传上对马立克氏病毒具有较 大抵抗力的鸡，还具有成熟早、产蛋高等特点。通过抗病育种筛选，可以达到通过遗传控制 疾 病的效果。Hutt和Cole在三十年代初开始的工作，奠定了遗传选择控制疾病的基础。不同 品系鸡间在马立克氏病易感性方面存在着很大的差异。现已人工选育并维持了几个对马立克 氏病(ND)具有遗传抵抗力的品系。选育方法有两种，其一是利用后裔检测法或用感染种鸡群 的幸存者进行繁殖，培育的抗病品系中易感鸡少于5%，而未经选育群体中易感鸡达50%以上 。 国内李康然(1993年)已建立了500羽的抗病核心群。另一种选育方法以血型为基础，依赖于M D抵抗力与B21之间的密切相关。由于免疫鸡群与非免疫鸡群对MD的抵抗力改变并不 完 全一致，有人建议抗MD鸡群的选育应在免疫鸡群中进行，但目前的选育工作多是在非免疫鸡 群中开展。鸡白血病/肉瘤是由禽反转录病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，这类疾 病 的发生与宿主的基因组成有关。在人工选育时，未知父母代的基因型可以通过其子代与设定 亚群呈隐性的试验鸡进行交配，根据特殊的交配试验中易感性和抵抗性子代的分离，即可确 定未知父母代的基因型。子代表型的鉴别，可以经过尿膜接种劳斯肉瘤病毒(RSV)进行痘斑 计数将鸡胚分为易感性和抗性鸡胚或将RSV接种雏鸡颅腔内，根据死亡存活计数率划分。 由 于抵抗力可能是由多基因控制的，因此这一方法尚未推广。[BT3](二) 基因工程抗病 毒感染育种 [HT5SS]基因工程抗病毒育种是近年来提出的新设想，是预防兽医学研究的国际前沿领 域，具有十 分重要的学术意义和发展前景，有着巨大的潜在经济效益。基因工程抗病毒育种可分为 二 个阶段：首先构建转基因动物，然后以转基因动物为亲本进行常规育种。目前应用的抗病毒 基因主要有如下几类。[BT4]1.抗病毒细胞因子及其相关物质的 基因(1) 细胞因子基因：干扰素(IFN)、白介素(IL)等是动物体内的生物活性因子，它们 具有抗病毒、抗肿 瘤及免疫调节等功能。将这些具有抗病或抗病相关物质的基因，经体外克隆和构建，导入动 物的受精卵内，有可能培育成功具有病毒抗性的转基因动物。目前，IFN转基因动物的培育 研究已在国内外相继获得成功，IL也于转基因鼠体内产生了明显的生物学效应。(2) Mx蛋 白基因：Mx蛋白是由IFN诱导产生并具有明显抗病毒活性的胞内蛋白。Arheiter等将小鼠Mx1 蛋白的cDNA置于IFN或病毒诱导性启动子的控制下，导入对流感病毒敏感的小鼠受精卵内 ，获得的转基因小鼠可以抵抗高剂量甲型流感病毒的攻击。(3) IFN受体基因：IFN通过与 细 胞表面相应受体结合，诱导细胞产生抗病毒蛋白而实现其抗病毒作用。研究表明，αIFN 和β－IFN通过同一受体与细胞相结合，因此，可以通过增加机体细胞表面受体数量， 充分发挥IFN的间接抗病毒作用。Lutfalla等已经克隆获得人的α－IFN受体基因，并在小鼠 细胞表面实现表达。研究结果证明，它与α－IFN和β－IFN具有很高的亲和性。将该基因导 入动物 受精卵， 有可能培育成功IFN高反应性的转基因动物——通过IFN受体介导增强动物的抗病 毒能力。[BT4]2.病毒结构蛋白基因应用病毒衣壳蛋白基因进行抗病毒转基因研究，最初报道 于植物。Abel等培育成功了携带花叶病毒衣壳蛋白基因的转基因烟草植株，这些转基因植株 均表现出延迟发病的抗病性。Beachy对抗病机制作了探讨，认为转基因植物阻止了病毒RNA 的释放与表达。在动物病毒研究方面，尚未见有关类似成功的报道。但Sambrook等将流感 病毒血凝素(HA)基因导入小鼠受精卵，在小鼠的胰β细胞表面HA获得表达。病毒攻击后 ，转基因小鼠产生高滴度的抗HA抗体，说明机体并未产生对HA的免疫耐受。它提示我们，利 用病毒保护性抗原基因有希望培育出抗病毒的转基因动物。[BT4]3.病毒中和性单克隆抗体基因 抗体的可变区是与相应抗原进行特异结合的部位，即抗体的活性部位。将抗病毒中和性单克 隆抗体的可变区基因通过反转录途径进行克隆，构建表达该区的重组基因，能够表达该单抗 的有效成分用于治疗。如果将该基因导入动物受精卵中进行种系转化，培育含该基因的转基 因动物，也将为抗感染育种提供一条新途径。在这方面，Ye等克隆了抗狂犬病病毒中和性 单 抗可变区基因的研究已初获成功。[BT4]4.反义RNA反义RNA最初发现于原核生物，它们以自然存 在的方式，通过碱基配对，特异性地与mRNA结合，阻止mRNA的翻译，是存在于原核生物中 的 一种基因表达调控因子。后来，在真核细胞中也发现了一些类似反义RNA作用的RNA小分子。 通过基因转移技术证实了反义RNA在真核细胞中有抑制或 关闭mRNA翻译的功能。研究表明，病毒RNA的不同部位均有一定程度的反义抑制作用。因而 针对不同病毒的基因结构和调控序列设计相应有效的反义表达质粒，就可实现抑制病毒的目 的。反义核酸抑制病毒复制的试验虽在培养细胞获得成功，但仍少见应用于植株和整体动 物的报道。据有关资料介绍，美国一家公司将合成的反义PG(聚乳糜酶)基因转化西红柿植株 ，其结出的西红柿不易软化，有利于保存和运输。另据介绍，美国研究人员正从事应用反义 抑制技术培育抗白血病转基因鼠的研究，并已获得初步成功。我们也证实了抗猪瘟病毒反义 RNA在培养细胞上对猪瘟病毒的抑制作用并正在开展转基因家兔和转基因猪的研究。 可见，应用 反义RNA进行抗病育种研究，是一个很有价值的探索领域。[BT4]5.RibozymeRibozy me可译为 核酶，有人称之为基因剪刀，它是一种天然的RNA小分子，这种RNA小分子具有催化RNA切割 反应的功能，可以序列特异性地切割RNA。研究表明，Ribozyme具有决定其切割反应特异性 和切割活性的结构，它们与靶RNA具有对应关系。因此，只要已知的某种病毒的RNA序列， 就可以设计并合成相应的抗病毒Ribozyme，体外试验结果表明，人工合成的Ribozyme能够切 断动物病毒的RNA。目前澳大利亚CSIRO的研 究人员已经设想通过Ribozyme开展培育抗病毒转基因动物。Ribozyme抗猪瘟育种在我国也已 开展。看来Ribozyme在抗病毒育种方面也有潜在的应用前景。[BT4]6.MHC等位基因即主要组织相容性抗原复合体基因。MHC基因是参与调节机体免疫反应的基因群，其中 很多等位基因与病毒性传染病的抗性有关。根据MHC基因的表达产物的性质与功能不同，可 将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类抗原。其中Ⅱ类抗原主要存在于巨噬细胞和B细胞表面，是T细胞的激 活因子，尤其是巨噬细胞表面的Ⅱ类抗原，当其与经巨噬细胞降解的病原体分子结合后，形 成T细胞的第一激活信号，从而启动细胞和体液免疫反应。动物在感染病毒后，能否发生免 疫反应，主要决定于Ⅱ类抗原识别病毒抗原分子，并与之结合的程度。有些动物对某种病原 特别易感，原因之一就是缺乏相应的Ⅱ类抗原。鸡的MHC(即B)编码基因组分为B－F、B－G和 B－ L三段：其中B－F编码Ⅰ类抗原；B－L编码Ⅱ类抗原；B－G为禽类所特有，编码Ⅳ类抗原， 存在 于红细胞等多种细胞表面，参与免疫调节。最近的研究表明，B－G和B－F都与鸡马立克氏病 ( MD)的抗性有关。人们正在试图以具有天然抗MD的B21/B21鸡为研究对象，鉴定和分离抗MD基 因。由于基因操作技术的不断发展，目前可以将两个或多个抗病毒基因克隆至同一载体中。将这 样的多重抗病毒基因导入动物体，能使不同抗病毒功能的基因产生协同作用。如将反义RNA 和Rib ozyme融合在一起，既可阻止病毒RNA的翻译，又可将病毒RNA切断，从而大大增强其抗病毒 作用。又如将Mx基因与中和性单抗可变区基因融合在一起，不仅可以发挥单抗可变区的胞外 0抗病毒作用，而且可以发挥Mx的胞内抗病毒作用。同样，反义核酸与中和性单抗可变区 基因融合，既有核酸水平的抗病毒作用，又有蛋白水平的作用。总之，随着胚胎学、分子生 物学和基因工程技术的不断发展，抗病毒感染育种研究将不断深入并取得进展。
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