组织细胞在体外增殖的条件较细菌等微生物严格得多,尤其是培养液要接近体内条件,才能使细胞发育增殖。首先要着重指出的是,各种细胞培养用的溶液都是由水配制的,因此水的质量至关重要。要应用一般二馏水再经玻璃蒸馏器蒸馏一次的三馏水。也可将二馏水通过离子树脂柱处理一次,获得电阻150万欧姆以上的去离子水,主要用于配制洗液。所用的化学药品至少是分析纯试剂或生物学试剂。
1.Hanks液〖HT〗用于冲洗动物组织和细胞以及配制胰酶等分散剂和营养液等,具有等渗和一定的酸碱缓冲能力。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗160g〖〗KCl〖〗8g〖〗MgSO4•7H2O〖〗2g〖〗MgCl2•6H2O〖〗2g〖〗加水〖〗至800ml〖〗〖〗〖〗CaCl2〖〗28g〖〗加水〖〗至100ml〖WX)〗将上述两种溶液混合后,加水至1000ml,并加2ml氯仿作为防腐剂,保存于0～4℃冰箱内。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗Na2HPO4•12H2O〖〗304g〖〗KH2PO4〖〗120g〖〗葡萄糖〖〗2000g〖WX)〗溶于800ml水中,最后加入100ml04%酚红液〖ZW(〗04%酚红液:称取酚红,置研钵中逐渐滴入01mol/LNaOH,不断研磨至颗粒完全溶解,01mol/LNaOH的总加入量为1128ml,再加入去离子水至所需量,即为04%酚红溶液。〖ZW)〗。加水至1000ml,加2ml氯仿防腐,保存于0～4℃冰箱内。按下述比例配成Hanks液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗1份〖〗原液乙〖〗1份〖〗水〖〗18份〖WX)〗10磅15分钟灭菌后,置0～4℃冰箱内备用。使用时于100mlHanks液内加入35%NaHCO3液,将pH调至72～76。
2.Earle氏液〖HT〗成分与Hanks液相近,但缓冲作用更强些。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗680g〖〗KCl〖〗40g〖〗NaH2PO4•H2O〖〗14g〖〗葡萄糖〖〗100g〖WX)〗将以上各成分溶解于水中,最后加水至500ml。加氯仿1ml防腐,置0～4℃冰箱内备用。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗20g〖〗MgCl2•6H2O〖〗17g〖〗04%酚红液〖〗50ml〖WX)〗将以上各成分溶解于水中,最后加水至500ml,加氯仿1ml防腐,置0～4℃冰箱内备用。按下述比例配成Earle氏液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗1份〖〗原液乙〖〗1份〖〗水〖〗18份〖WX)〗10磅15分钟灭菌后,置0～4℃冰箱内备用。使用时加入NaHCO3液,如上调整pH。Hanks液和Earle氏液是组织培养中最常用的洗液,也是配制营养液的基础液。
3.磷酸缓冲盐水(PBS)〖HT〗由于Hanks液和Earle氏液的pH值都是用二氧化碳-重碳酸盐缓冲系统维持的,故在配制长时间接触空气的液体时,例如病毒稀释液以及组织抽提液等,应该使用PBS。(1)原液甲〖WX(!10KG5,7YQ〗NaCl〖〗800g〖〗KCl〖〗020g〖〗Na2HPO4〖〗115g〖〗KH2PO4〖〗020g〖〗04%酚红液〖〗5ml〖WX)〗溶于500ml水中,加入5ml04%酚红液,加水至800ml。10磅15分钟灭菌备用。(2)原液乙〖WX(!10KG5,7YQ〗MgCl2•6H2O〖〗01g〖WX)〗溶于100ml水中,10磅15分钟灭菌备用。(3)原液丙〖WX(!10KG5,7YQ〗CaCl2〖〗01g〖WX)〗溶于100ml水中,10磅15分钟灭菌备用。按下述比例配成工作液:〖WX(!10KG5,7YQ〗原液甲〖〗8份〖〗原液乙〖〗1份〖〗原液丙〖〗1份〖WX)〗配制胰酶时需用无钙的PBS,可用水代替原液丙。
4.抗生素溶液〖HT〗抗生素虽不提供营养,但能防止细菌和霉菌污染,它的应用,促进了组织培养的发展,是细胞营养液中不可少的成分。(1)防止细菌污染:通常将青霉素和链霉素配制成混合试剂,简称“双抗”,效果比单用好。配制时将100万单位青霉素G和100万单位链霉素溶解于灭菌的100ml三馏水(或平衡盐溶液)中,使每ml含青霉素1万单位和链霉素1万单位。为防止支原体污染,常在双抗中加入卡那霉素,这样即称“三抗”,其配制浓度与链霉素相同。将配制好的联合抗生素溶液分装小瓶后,置-20℃以下低温冰箱保存备用。使用时,每100ml洗液或营养液中加入上述抗生素液1ml,则每ml使用液中抗生素的浓度分别为100单位。在容易发生污染的炎热潮湿季节,可加大使用浓度1倍。(2)防止霉菌污染:两性霉素具有强烈的抑制霉菌作用。配制时取静脉注射用两性霉素B(50mg),溶于250ml灭菌水中,配成每ml含200μg的溶液,分装小瓶,置-20℃低温下保存备用。使用时,于100ml营养液内加入上述两性霉素溶液05～1ml,使其最终浓度为1～2μg/ml。近年国外使用一种叫Fungizone的抗霉菌素,用Hanks液配制成每ml含量为100μg的溶液,分装小瓶后,置-20℃以下低温冰箱保存备用。使用时,于每100ml营养液中加入上述溶液1～5ml。(3)抗生素的用法和保存:常规的细胞培养物,一般只加双抗,只当存在霉菌或支原体污染的较大危险时,才再加入相应的其它抗生素,例如在潮湿多雨季节,可以考虑加1～2μg/ml的两性霉素等。已经污染的细胞培养物,照例全部废弃。只在特殊情况,例如新培育的或者特需的某一细胞株发生污染时,才考虑应用高浓度抗生素处理的办法。例如应用加有比正常量大5～10倍的两性霉素、金霉素、卡那霉素或庆大霉素等的营养液,给污染细胞培养物换液,每天一次,连续3～4次。此后改用正常含量抗生素的营养液进行传代,连传4代,如果没有污染现象出现,即可假定地认为这个细胞培养物的污染已经消除。由于高浓度的抗生素会对细胞培养物呈现毒性作用,而各种抗生素抑制不同微生物种类的作用又不一样,因此,应在进行上述高浓度抗生素处理之前,先作各种抗生素对污染微生物的抑制试验以及该细胞培养物对相应浓度抗生素的耐受性试验,以便找出最合适的抗生素及其应用浓度。在-20℃低温保存的上述各种抗生素溶液,可以使用3个月。
5.碳酸氢钠溶液〖HT〗此液与气相CO2一起,可对各种洗液或营养液提供缓冲系统,碳酸氢钠同时也是一种重要的代谢物。通常配成56%、75%或88%浓度的溶液,10磅高压灭菌15分钟(为防止胶塞在高压灭菌时崩掉,可先用纱布和麻绳将其扎紧),分装小瓶,并用橡皮塞盖紧,保存于4℃冰箱内备用。配好的碳酸氢钠溶液也可应用玻璃滤器除菌。
6.细胞分散剂〖HT〗是能使组织块或成片细胞分散成单个细胞的化学制剂或生物制剂。胰酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)和灰色链丝菌酶是当前最主要的细胞分散剂。(1)胰酶:胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解,导致细胞间质水解而使组织块或单层细胞“消化”为分散的单个细胞。但如作用时间太长,也可使细胞发生严重损伤。配制时通常是取粉状胰酶(1:250)25g,溶于pH74～76的无钙PBS中,作成025%溶液,用玻璃除菌滤器或除菌滤膜过滤后,分装小瓶,保存于-20℃低温冰箱内备用。作者实验室的方法是用普通Hanks液将胰酶配成1%的浓度,除菌过滤后,-20℃冻结保存。使用时再以Hanks液稀释成025%的浓度,并将pH调整到74～76。由于动物血清中含有抗胰酶物质,可使胰酶丧失蛋白分解作用,故在应用胰酶“消化”组织块或单层细胞时,应先充分冲洗,除去组织块或单层细胞中残留的血液或血清成份。为了防止污染,可在胰酶溶液中加入抗生素,使每ml胰酶溶液分别含有100单位青霉素、100单位链霉素、1μg两性霉素B以及10μg金霉素、庆大霉素或卡那霉素。(2)乙二胺四乙酸二钠(EDTA):某些组织,特别是上皮组织,需要有钙、镁两价离子的存在,才能保持其完整性。如果应用某种物质或方法除去这些离子,就可使组织细胞分散脱离。EDTA就因结合组织中的这些离子,使组织细胞分散而被用作细胞分散剂。也是由于这个缘故,配制EDTA溶液必须无钙无镁,且在应用EDTA“消化”细胞后,应该将其倾弃,以免影响细胞生长。EDTA主要用于上皮细胞类继代细胞株或传代细胞系的传代。也曾用于肾脏等组织的“消化”,但其效果似乎不如胰酶。有人建议应用胰酶和EDTA的混合液“消化”肾脏组织,据认为可获得极高的细胞产量。应用这种混合液“消化”上皮细胞类继代细胞株或传代细胞系,效果很好,已被某些实验室作为通用方法。EDTA的使用液为其002%溶液,配制方法如下:〖WX(!10KG5,7YQ〗EDTA〖〗005g〖〗NaCl〖〗200g〖〗KCl〖〗005g〖〗Na2HPO4〖〗029g〖〗KH2PO4〖〗005g〖〗细胞培养用三馏水〖〗250ml〖WX)〗滤纸过滤,分装小瓶,10磅10分钟高压灭菌后,保存于0～4℃备用。(3)灰色链丝菌酶(Pronase):是由灰色链丝菌提取的一种酶制剂,是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。某些实验室应用灰色链丝菌酶“消化”鸡胚和鼠胚组织,并用于许多上皮细胞类和纤维样细胞类单层细胞的传代,据认为“消化”作用比胰酶强,而且消化下来的细胞更为分散和均匀。但对某些传代细胞系,例如HeLa细胞和KB细胞等,应用灰色链丝菌酶“消化”后,却常出现小片状细胞块,说明“消化”不完全。某些学者认为灰色链丝菌霉最适于某些成纤维细胞二倍体株的分散,应用005～01%浓度的灰色链丝菌酶甚至可在几秒钟内使细胞从瓶壁上脱落和分散。但是必须指出,由于动物血清中没有此酶的天然抑制物,故将细胞分散以后,必须应用等渗盐溶液充分冲洗,并用低速离心沉淀方法除去残留的灰色链丝菌酶,以免其继续损害细胞。配制灰色链丝菌酶使用液时,可取025g灰色链丝菌酶,溶于500mlPBS中,混合并在室温放置半小时后,低速离心沉淀10分钟,除去其中未溶的颗粒,并经玻璃滤器或滤膜过滤除菌,分装小瓶,-20℃低温保存备用。也可称取1g灰色链丝菌酶,与少量PBS液混合调成糊状,再行逐渐添加PBS液,并不断搅拌,直至最后达100ml,并呈均匀的乳状液。置4℃冰箱内几个小时,低速离心沉淀,除去颗粒,并用滤器过滤除菌后分装小瓶,置-20℃保存,可用几个月。使用时,待其融化后用平衡盐溶液进一步稀释为005%或01%的溶液。上述胰酶、EDTA和灰色链丝菌酶等三种分散剂,其特性和作用原理不同,使用上也各有优缺点。因此,各个实验室必须根据自己的经验和条件,选用最适于各该细胞的分散剂。现在常用胰酶和EDTA混合液作为细胞分散剂,据认为“消化”效果优于单独一种分散剂。作者等试用于多种继代细胞株和传代细胞系,效果也较好,但似乎更适用于上皮样细胞类的消化、分散。配制时一般先按下方配成10倍浓缩液,使用时临时以双馏水作10倍稀释后应用。〖WX(!10KG5,7YQ〗胰酶〖〗25g〖〗NaCl〖〗400g〖〗KCl〖〗20g〖〗葡萄糖〖〗50g〖〗NaHCO3〖〗29g〖〗EDTA〖〗10g〖WX)〗以上依次溶于450ml三馏水中。为使胰酶充分溶解,可置37℃水浴加温,务使液体完全清亮。随后加入1%酚红1ml(也可不加),再加10万单位双抗溶液5ml(也可不加)。加足三馏水至500ml,以G-6玻璃滤器或相应的滤膜滤过除菌,分装后置-20℃保存。临用时用三馏水稀释。
7.谷氨酰胺〖HT〗配制成3%溶液,即称3g谷氨酰胺溶解于100ml三馏水中,振荡促溶,用玻璃滤器或滤膜过滤除菌,分装小瓶后置-20℃以下冰箱内保存备用。此溶液在冰冻保存时析出白色沉淀物,融化混合后即可溶解。使用时在每100mlE-MEM或其它不含谷氨酰胺的营养液中加入此液1ml。
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