营养液是组织培养系统中细胞赖以生长和增殖的直接环境,因此不仅要求供给各种营养物质,例如氨基酸、糖类、维生素和无机盐类等,而且必须保证适宜的温度、酸碱度、渗透压和气相。目前所用的各种营养液是根据细胞的营养要求和生长特性而精密设计和配制的所谓人工综合营养液,在培养时添加血清或某些细胞生长因子即可满足细胞的生长繁殖。营养液在细胞培养过程中可分为生长液和维持液。前者是在细胞培养初期使细胞发育增殖的液体,因此要求营养条件丰厚;后者是在细胞基本发育增殖后加入的维持性营养液,它与生长液的主要差异是血清含量减少或不含血清。维持液可使细胞代谢趋缓,从而延长细胞的活存时间,以利于实验的进行。
1.血清〖HT〗动物血清中具有细胞生长所必须的各种营养因子,它能促进细胞的贴壁和生长,且有很强的酸碱缓冲能力。许多实验室直接利用血清(或以血清为主要成分)成功地培养了许多细胞种类。作者等应用犊牛血清培养马属动物以及猪、狗等动物外周血液中的白细胞(大单核细胞),取得很好效果。试用全血清培养驴胎继代细胞、猪肾传代细胞、人肾传代细胞以及小白鼠胚细胞、鸡胚细胞和仓鼠肾细胞等原代细胞也能获得较好的生长,但迅速衰老。当前,动物血清通常用作营养添加物,亦即用其丰富或补充其他营养成分,使营养液具有更完全的营养成分。仅在培养外周血液白细胞或骨髓细胞时,有时应用全血清。一般认为动物血清中具有细胞生长因子或称生长剌激因子,有明显的促细胞生长作用。故在培养各种细胞时一般都要求加入适量(例如5～10%)的血清,但维持液可减少血清用量,甚至全部不用血清。各种动物的血清都能应用,而且并不要求同种血清,例如胎牛血清或新生犊牛血清可以用于人、马、猪、狗、鼠等多种细胞的培养。但也有人强调应用同种血清,如在培养人类细胞时应用或添加少量的人血清等等,据认为有利于细胞贴壁。由于同一种动物的不同个体的血清,在组成成分上可能有差别,因此最好应用采自几个个体的混合血清。混合血清的数量较大,进行一次鉴定试验,可以长期使用。某些血清可能对细胞呈现毒性作用,这种毒性作用似与血清所含的脂蛋白,特别是胆固醇和三磷酸甘油酯有关。应用灭菌玻璃粉处理新鲜血清,或者应用石棉或玻璃滤器过滤,因其吸附脂蛋白,常能降低血清对细胞的毒性作用。但须注意,石棉滤板中可能含有毒性物质,故在应用石棉滤器过滤时,应将最初滤出的部分血清废弃。血清中还可能存在一些能遮盖细胞膜上病毒受体的物质,从而降低和影响病毒对细胞的感染。作者等应用细胞吸附法处理血清,成功地提高了某些病毒的阳性分离率。具体方法是:首先培养病毒分离时将要应用的那类细胞,待其长成细胞单层时倾弃营养液并用等渗液冲洗2遍,甩干后在细胞单层上加入56℃灭活的血清,厚度不超过2mm。先置37℃感作2小时,再放4℃冰箱4小时或过夜。随后吸出上层血清,低速离心后备用。每个批次的血清,都应在使用前对相应细胞作培养试验。多数实验室应用新生犊牛血清,因其较易大量采集,且有很好的细胞培养效果。近年市场上已能购到犊牛血清。根据各实验室的具体条件和需要,也可应用马血清、大牛血清、绵羊血清或鸡、兔血清等等,但是必须经过试验,而且效果多不如犊牛血清,当然胎牛血清最好。(1)犊牛血清:犊牛出生后,不给吮乳,尽早由颈动脉无菌放血。可用3000～5000ml的三角烧瓶作采血瓶。采血前先向瓶内加入30～50ml等渗盐溶液,湿润瓶壁,以免采血后血凝块粘附瓶壁,影响血凝块收缩。采血后置37℃温箱或水浴中1小时,随后再置室温或4℃冰箱内1天,倾出血清(其中混有较多红细胞),分装于大离心瓶中,以3000r/min的速度离心沉淀半小时,吸取上层透明的血清,并视需要分装于50～100ml灭菌瓶中,置-20℃以下低温冰箱中保存备用。使用前置56℃水浴中加温灭活30分钟,并作无菌、毒性和细胞培养试验。如无大型离心机,也可将血液采入几个较小的瓶内,每瓶采血量不超过瓶容量的1/2。将瓶斜放,置37℃1小时,再放4℃24小时,即可吸取上层透明血清。仅其下层混有红细胞的血清需要离心沉淀处理。从每头公犊牛约可获得1000～1500ml血清。这种犊牛血清与胎牛血清相近,培养细胞的效果很好,但对于某些病毒,例如细小病毒、冠状病毒和副粘病毒等的培养,犊牛血清具有比较明显的病毒抑制作用,故在分离和培养这类病毒,特别是由病料初代或前几代分离和培养这类病毒时,最好应用5月龄以内的胎牛血清。胎牛血清通常由剖腹取胎后获得。(2)牛、马、羊血清:通常由颈静脉采取,或屠宰时由颈动脉放血采取。采血前必须禁食1天,以免血清因混有乳糜而混浊。应用成年动物血清培养细胞,效果不如犊牛血清。由于自然感染或疫苗接种,成年动物血清中还常含有抗病毒抗体。其所含有的病毒抑制物质,也常比犊牛或胎龄动物血清中的含量高,因此,在供病毒培养用的细胞营养液内,必须避免应用可能含有这些抗病毒因子的血清,如在培养乙型脑炎病毒的细胞培养液内,当然不能添加含有乙型脑炎抗体的血清。(3)其他血清:如兔血清和鸡血清等,由于产量太小,一般只在特殊需要,例如对特定细胞的培养时才应用。
2.血浆〖HT〗是早期组织培养工作中培养组织块时常用的营养液和固体支持剂。现在很少使用。
3.组织浸出液〖HT〗也是早期组织培养用的营养成份,多用9～11日龄鸡胚制造。添加血清的人工综合营养液完全可以代替组织浸出液,因此目前不常应用。
4.05%乳白蛋白水解物〖HT〗乳白蛋白水解物是乳白蛋白、乳球蛋白和血清蛋白的水解产物,含有大量多种氨基酸和肽类,比E〖DK〗MEM所含的种类还多。应用Hanks液或Earle氏液配制的05%乳白蛋白水解物,特别是在添加犊牛血清后,可以培养哺乳动物绝大多数的组织细胞,例如肾、肺、皮肤、皮下结缔组织、肌肉和鸡胚细胞等。由于它廉价,主要用于对营养要求不十分严格的细胞培养。配制时,称取乳白蛋白水解物5g,溶解于1000mlHanks液或Earle氏液中,待其完全溶解,按需要量分装于玻璃瓶中,10磅高压灭菌20分钟,冷却后保存于4℃冰箱内备用。使用前调整pH,并添加抗生素和血清等其他成分。
5.人工综合营养液〖HT〗此类营养液是根据细胞的营养要求,逐项配合各种化学物质,并按照实验结果加以改进完善。人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶和辅助生长因子等。天然营养液的成分复杂,而且常因动物种类、个体和制备方法的不同而有质量上的差异,有时甚至含有抑制细胞生长或病毒增殖的物质。人工综合营养液则不同,由于它是由已知成分配制的,所以质量稳定。目前已研制成功无血清培养液,即培养时不加动物血清,也能够保证细胞的正常生长繁殖。因此适于应用细胞培养制备或生产单克隆抗体及各种基因工程表达的生物活性多肽因子,也可用作精细的生化学定量分析,研究细胞的生长和代谢规律。近年来设计的人工综合营养液配方多达几十种,但最常应用的是Eagle氏最低要素营养液(简称E〖DK〗MEM)、RPMI1640、199和L15等。虽然不同的营养液各有特点,但实际上均可用于多种细胞的培养。所有人工综合营养液至少含有13种氨基酸,即精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。E〖DK〗MEM就只含有这13种氨基酸,维生素种类也比较少,但对多种细胞都能培养。199含有的氨基酸种类多达21种,维生素的种类也很多,主要用于营养条件要求苛刻的细胞。RPMI1640和L15的营养成分介于E〖DK〗MEM和199之间。最近一些厂家又推出很多新产品,如美国生命技术公司的“干粉无需CO2培养基”、“DMEM新配方干粉培养基”、“RPMI1640新干粉配方培养基”和“肝细胞培养基”等多种人工综合营养液。现在我国也有多种国产营养液、浓缩原液及合成粉剂出售,使用时只须按说明书要求,以三馏水溶解或稀释,用滤器过滤除菌(浓缩原液用灭菌三馏水稀释后即可使用)后即可使用。E〖DK〗MEM因不含谷氨酰胺(配制营养液时现加),故可用8磅15分钟灭菌。在使用人工综合营养液配制细胞生长液时,视细胞要求加入适量血清,通常为4%～20%;维持液血清量较少,一般为1%～3%,有的可不加血清,再加入规定量的抗生素溶液,最后滴加56%碳酸氢钠溶液修正pH为72～74即可使用。因E〖DK〗MEM干粉制剂不含谷氨酰胺,配制时要向每100ml营养液中,加入3%谷氨酰胺溶液1ml,然后再修正pH。
6.无血清人工综合营养液〖HT〗为了排除血清对实验的干扰,从50年代开始,人们开始研制不含血清的细胞培养液。通过多年实验研究,已发现可以代替血清的营养成分:①某些激素和生长因子,如胰岛素、生长激素、前列腺素和表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等20余种;②结合蛋白类,如转铁蛋白(TF)和无脂肪酸白蛋白等;③贴壁和铺展因子,如冷不溶球蛋白、血清铺展因子和胎球蛋白等;④某些低分子量营养因子。其中最多用的是胰岛素、转铁蛋白和硒盐。配制时,根据培养细胞的种类,添加营养成分。作为无血清培养液的基础,最多用的是F12和DME的1∶1混合液,其次是RPMI1640和199等。近年一些外国厂家推出了多种适宜于不同细胞培养的无血清培养基,有干粉和浓缩液两种产品,如“内皮细胞无血清培养基”、“造血干细胞无血清培养基”、“人内皮细胞无血清培养基”、“杂交瘤无血清培养基”和“巨噬细胞无血清培养基”等。不言而喻,这些商业性产品的出现,为无血清营养液的推广应用创造了方便条件。
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