在将原代细胞继续传代的过程中,往往可以发现原来占优势的一些细胞逐渐减少乃至消失,而另一些细胞却可能后来居上,取而代之。例如原代肾细胞培养物中主要是上皮样细胞,纤维样细胞较少或很少。但在继代培养过程中,后者逐渐增多,3～4代或更多一些代次以后,上皮样细胞明显减少以至消失,而大部或全部成为了纤维样细胞。其他组织的培养物,例如肺和骨髓等,也都存在这种情况。应用异种血清,例如继代培养猪肾细胞或仓鼠肺细胞时应用犊牛血清,最易出现这类现象。这是因为动物器官和组织中经常含有许多种类的细胞,在原代肾培养物中,肾上皮细胞最多,故在显微镜下观察,以上皮样细胞为主。但将原代培养物作继代培养时,由于纤维样结缔组织细胞的生长比上皮细胞快得多,逐渐改变两者的数量关系,最后成了纤维样细胞的一统天下。应用同种血清,例如以犊牛血清培育牛肾细胞,以猪血清培育猪肾细胞,较易保持其上皮细胞类型。但是,更好的办法是采取纯化技术,选取并育成所需细胞类型,例如上皮细胞的细胞株。再者,即使已经纯化的细胞株,在长期的传代过程中,也可能因发生变异而使细胞株在形态、生理特性和对病毒的敏感性方面呈现不一致现象。这也要求我们采用纯化筛选手段,以便保证细胞株的均一和稳定。所谓细胞克隆技术,就是从一般细胞株(系)的培养物中,获得由一个单细胞后代增殖的细胞群体。所获得的这种生物学性状一致的细胞培养物称为克隆化细胞株,从而达到细胞纯化筛选的目的。应用这种纯化细胞株进行的实验不仅科学可靠,而且能提高细胞的敏感度和可重复性。如流行性出血热病毒的分离培养曾是医学病毒实验室的一个难题,但在应用细胞克隆技术,从Vero细胞中获得了对病毒敏感的Vero〖DK〗E6纯化细胞系后,一举分离成功,难题迎刃而解。如前述,日常应用的细胞株(系)都是经过长期多次传代的,由于传代过程中各种条件的变化,以及细胞本身的生物变异现象,不断产生细胞分化,结果成为在生物性状上不尽一致的细胞群体。可见应用细胞克隆技术,解决细胞的纯化问题就显得十分必要。各种细胞株的单胞增殖率明显不同。所谓“单胞增殖率”,是指将一定数量的分散细胞接种入培养瓶或平皿内,待其生长增殖,计算已经形成的细胞集落数目,其占有原来种入的细胞数的百分比,就是单胞增殖率或称集落形成率。传代细胞,例如HeLa细胞的单胞增殖率很高,可达10%～20％,因此易在单细胞分离培养中获得纯系细胞。原代细胞和继代细胞的单胞增殖率较低,通常在2%～3％以下,甚至不到1％,单细胞分离培养的成功率也相应降低。细胞种类当然也是决定单胞增殖率的一个重要因素,例如肿瘤细胞的单胞增殖率显著高于正常细胞,结缔组织细胞和上皮细胞又比其它细胞易于形成纯系细胞等等。现将单细胞分离培养技术中几种比较常用的方法介绍如下:
1.毛细管法〖HT〗是将单个细胞培养于极微量的营养液内,使其能够改变周围营养液,使营养液“条件化”,以适应细胞的生长和增殖。通常应用199人工综合营养液和E〖DK〗MEM液等,内加20％的犊牛血清。为使这种营养液能够更好地适应单个细胞的生长和增殖,可以预先加以“条件化”,亦即取新培养而即将长成单层的同类细胞培养物,倾弃原来的营养液,加入新营养液,37℃培养1天后,吸出营养液,以微孔滤膜或以3000r/min的速度离心沉淀30分钟,除去可能混悬其中的细胞,取上清液装瓶备用。应用时加入1％的葡萄糖,并将pH调整至70～72。取内径5～6mm、壁厚05～07mm的优质玻璃管,截成5cm长,置硫酸重铬酸钾清洗液内浸泡1天,取出后用自来水和蒸馏水反复冲洗,甩干后浸泡于三馏水或去离子水中2天,每天换水1～2次。最后再用三馏水或去离子水冲洗后烤干。于酒精喷灯上将其拉成内径为005～01mm的微毛细管,并截断成10mm长的小段。再用三馏水或去离子水浸泡过夜,取出后置光面滤纸上,放入平皿,干热灭菌备用。准备50～100个小培养瓶或优质青霉素瓶,并按培养瓶的形状逐个加入一块稍小于培养瓶底的优质玻璃纸。玻璃纸需事先用分析纯的乙醚、酒精、丙酮和三馏水分别顺序地浸泡15分钟,随后用镊子送入培养瓶内,一起高压灭菌备用。根据细胞种类,用细胞分散剂将单层细胞消化下来,在上述已经“条件化”了的营养液内充分吹打成均匀分散的细胞悬液,并进一步稀释为每ml含1000～2000个细胞的细胞悬液,置灭菌小平皿内。迅速用钟表镊夹住微毛细管,将其一端浸入细胞悬液内,使细胞悬液自动吸入管内。置灭菌玻片上,上盖灭菌玻璃纸防尘,用低倍显微镜进行检查。挑选管内确实只有一个细胞的微毛细管,置入事先加有1～2ml营养液的培养瓶内(含玻璃纸),并用镊子或白金针将其送于玻璃纸的下面,并将玻璃纸展平,铺于瓶底。随即吸弃培养瓶中的营养液,使玻璃纸粘贴于瓶底,并将微毛细管夹于玻璃纸与培养瓶底之间。逐个操作完了之后,松松地塞上橡皮塞,并置5～10％CO2环境中于37℃培养2小时,取出后将瓶塞塞紧,继续培养。根据各该细胞的单胞增殖率,一般需作50～100管,有时甚至更多。两天后开始观察,此后每天或每隔一天观察一次,发现细胞由微毛细管端逸出并在培养瓶底形成细胞群落时,即可加入较大量的营养液,并考虑作传代培养。〖HT5H〗2.终点稀释法〖HT〗这种方法较为简便,即将处于旺盛生长期的单层细胞培养物用胰酶消化下来后,应用前述“条件化”了的营养液作高倍(从10-1到10-7左右)稀释,然后从10-5开始分别接种微量培养板,每个稀释度至少接种50个孔。从培养48～72小时后开始,逐日在倒置显微镜下观察,取最高稀释度有细胞增殖的孔,用胰酶消化并扩增培养后,继续按上述方法重复克隆,至少两次以上,即可获得克隆细胞株(系)。
3.微滴法〖HT〗先在洁净的60mm直径平皿底上铺放10mm直径或见方的盖玻片(8～10片),倾入灭菌液体石蜡,使有4～5mm的深度。用灭菌细玻棒将盖玻片沿皿缘作较规律的排列,各片之间及其与皿缘的距离约10mm。在盖玻片上方滴加“条件化营养液,使其恰好下沉于盖玻片上,形成5mm直径左右的液滴。随后用毛细管吸取单个细胞(操作方法如前),吹入于石蜡下的液滴中。如此重复操作,约作10～20个培养皿的培养,共计100～200多个细胞和液滴。盖上平皿盖,置5～10％CO2环境中,37℃培养。2～3天后开始检查,此后每天观察一次,并根据需要适当更换营养液,一般在10天左右长成细胞集落。此时即可吸弃细胞集落上的营养液,加入1滴01％胰酶,消化3～5分钟,适当吹打,使细胞脱离盖玻片,吸出细胞悬液,培养于另一小培养瓶中,并追加1～2ml新营养液,待其进一步生长增殖后传代。
4.饲养细胞层法〖HT〗为提高单细胞的生长增殖率,可以应用饲养层细胞法,即先培养HeLa细胞或猪肾传代细胞等单胞增殖率高的细胞,待其长成单层,用2000～4000R的X〖DK〗线照射(各该细胞株的X〖DK〗线照射剂量需经预备试验测定)。经过X〖DK〗线照射的细胞,不再能够分裂,但还保持其使营养液“条件化”的能力,并因提供“直接接触”和“代谢合作”而促进单个细胞的生长增殖。于照射后第2天吸弃营养液,胰酶消化,作成每ml含1～2×104个细胞的悬液。于聚苯乙烯微量培养板的小孔内,每孔加入这种已用X〖DK〗线照射的细胞01ml,同时加入1个待克隆的单细胞。加盖后置CO2环境中,37℃培养,饲养层细胞即全部脱落。而待克隆的单细胞,此时(7～10天)可能已生长增殖,即可进行胰酶消化和传代培养。
5.软琼脂法〖HT〗主要用于恶性变细胞和肿瘤细胞的分离培养和建立细胞株。因为正常动物组织的原代培养细胞和继代培养细胞,通常不能在液体和半固体呈现悬浮生长,而肿瘤细胞、传代细胞系以及由致瘤病毒或化学致癌物诱变的恶性变细胞,却常可在半固体营养琼脂内形成细胞集落。首先制备05％营养琼脂,亦即软琼脂。取125g优质琼脂或琼脂糖,加于800ml去离子水中,煮沸溶化,再加水至1000ml。按每瓶40ml的量分装,8磅20分钟高压灭菌。此为125％琼脂。应用时将其置水浴中融化,并保持于44℃水浴中。另配取40ml的2倍浓度的营养液(199或E〖DK〗MEM),加入犊牛血清和胰蛋白〖HT5,7SS〗月〖KG-*4〗〖HT5,7SS〗示〖HT〗磷酸盐液各10ml,混合后置水浴中,也使其达44℃。随后迅速将其倾入于上述44℃的琼脂中,充分转动混合,此即05％营养琼脂。吸取05％营养琼脂10ml铺加于60mm直径的平皿内,室温放置凝固,作为底层琼脂。另如前述方法制备细胞悬液,使每ml悬液中约含103～104个细胞,置37℃保温。迅速取此细胞悬液1份,加入于2份44℃营养琼脂内,充分混合后,吸取2ml覆盖于底层琼脂上。置5%～10％CO2环境中,37℃培养。每天在25～50倍的低倍显微镜下观察。约7～10天后开始形成01～02mm直径的细胞集落。如果培养时间超过10天,可在营养琼脂表面滴加2ml营养液,以免琼脂表面干燥。如有较大的细胞集落出现,即可应用毛细吸管将整个细胞集落连同琼脂一起吸出,移植于另一小培养瓶中的1ml营养液中,稍行吹打,将琼脂打碎,并用白金针将其挑出。将小培养瓶作静置培养,使细胞贴壁并生长成单层。
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