实验室内培养的细胞株,需要定期传代,这是一项繁重的工作。而且,由于传代次数增多,相应地增加了细胞污染和变异(包括恶性变)的危险性。二倍体细胞的建立,更要求减少传代次数,以免发生过早的衰老死亡。因此,细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作。这一问题现已基本获得解决,特别是细胞低温保存方法的成功,极大地保证和促进了细胞培养工作的发展。
1.细胞培养物的常温短期保存〖HT〗细胞株和传代细胞系的短期保存并不困难。将已长成单层的细胞于换液后置室温或20～22℃温度下避光保存,一般均可保持细胞的生活力达半个月以上(某些细胞,如BHK〖DK〗21细胞,最多能保存7天左右)。但维持液中的血清含量应提高至5%～10％。与动物组织块的保存方法不同,细胞培养物不宜在4℃保存。单层细胞在这种温度下易于发生退化现象,并且较快由培养瓶壁脱落;继续传代培养时,细胞活力也明显降低。如果传代培养时将培养温度由37℃降至32℃甚至30℃,则细胞生长缓慢,老化也迟,可以每隔15～30天传代一次。作者等试用30～32℃的温度培养HeLa细胞、人羊膜传代细胞、猪肾细胞(PK〖DK〗15和IBRS〖DK〗2)和驴胎继代细胞等,20～30天传代一次,细胞的形态和活力未见明显变化。如果细胞在这种温度下生长太慢,不能长成单层,可先将其置37℃培养,待其生长增殖而将形成单层时,再行移置于30～32℃培养。但必须指出,由于缺乏详尽的细胞学和病毒学上的鉴定数据,上述的细胞保存方法只是一种可被偶然采用的权宜之计,不能作为细胞保存的基准方法。在需长途运送细胞培养物,例如经火车或飞机送往远处时,可选择刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶,勿使培养瓶内存留空气。随后用橡皮塞紧塞瓶口,并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15～25℃左右。到达目的地后,将培养瓶内的维持液倒出,仅存留正常的维持液量,并置37℃温箱中培养1～2天,即可进行传代培养。如系炎热夏天,气温太高,而运输路途又远,则可取不漏水的塑料袋1个,放入若干冰块,扎紧袋口,并置入广口保温瓶内,同时放入已用纱布适当包扎的细胞培养瓶,使保温瓶内的温度保持在10～30℃之间。
2.细胞培养物的低温长期保存〖HT〗早在40年代,人们就已证明人类精子对-79℃乃至-196℃的低温具有一定的抵抗力。随后又发现,甘油对低温保存的动物细胞具有良好的保护作用:细胞悬液中加入甘油,可以明显地提高其在-79℃的活存率。60年代以来,另一种化学试剂——二甲基亚砜(DMSO)又被用作细胞低温保存的保护剂。应用甘油或DMSO已经成功地保存各种组织细胞,特别是在使用-196℃的液氮以来,已经可以几年或更长时间地保存细胞。实验证明,当细胞悬液的温度较快下降到0℃以下时,细胞内开始形成冰结晶,这种冰结晶是使细胞产生机械性损伤的主要原因。温度继续下降,细胞外相的冰结晶增多,残留液中的盐类浓度增高,水分从细胞内抽出,其结果,细胞内的可溶性物质特别是电解质在残余的少量水中逐渐浓缩,又使细胞发生渗透性休克。因此,细胞在被冷冻至0℃以下时,将先后或同时发生冰结晶形成、脱水和可溶性物质浓缩等三种变化。而在快速冰冻时,细胞膜又易发生损伤。但如果温度下降缓慢,例如每分钟下降1℃,则发生另外一种情况:细胞内并不出现冰结晶,冰结晶主要形成于细胞外,细胞本身只发生逐渐的脱水,并不遭受严重损伤。因此,“缓慢冰冻”是保护细胞,使之不致发生严重损伤的关键因素。由于细胞内冰结晶的形成和电解质的浓缩主要发生在-5℃和-10℃之间,因此只要严格控制0℃～-20℃范围内的温度下降速度,即可明显减轻细胞在低温冰冻过程中的损伤程度。甘油和DMSO是非电解性物质,具有较强的亲水性,而且易于穿透细胞膜,可以减轻冰结晶对细胞的机械性损伤作用;此外借助其弥散作用,又可置换细胞内的水分,避免因细胞内脱水而发生电解质浓缩,且使细胞不致发生绉缩。相反,已在低温冰冻保存的细胞,融解时却又必须十分迅速,否则也会产生严重的细胞损伤。因在缓慢融解时,当细胞由最低温度(例如-196℃)逐渐上升至-20℃～-5℃时细胞内也会形成冰结晶和发生电解质浓缩。因此,一般是将低温保存的细胞安瓿直接置入37℃～40℃的温水中,使其尽快融解,以减少细胞损伤。总结细胞低温保存的经验,可以归纳为一句话,那就是:“缓慢的冰冻和迅速的融解”。至于什么样的低温条件最有利于细胞保存?何种温度是其可以允许的上界?则还没有充分的研究。一般认为,保存温度最好低于-130℃,因在-130℃以下的低温下,细胞的生命活动降至最低点,有利于长期保存细胞。液氮是目前广泛应用的冰冻剂。(1)细胞悬液的制备:将已长成或即将长成单层的生长旺盛的细胞,例如培养2～3天又经换液1～2天的单层细胞,按该细胞的常规消化方法消化分散,并在该细胞常用的营养液内作成分散的细胞悬液,倾入离心瓶内,以500r/min离心沉淀5～10分钟,弃去上清液,于沉淀细胞内加入含10％DMSO或甘油的营养液(血清含量为10～15％),其量约为原营养液量的1／4。吹打混合并作必要的稀释,使成每ml含2～5×106个细胞的悬液。应该强调指出,在将DMSO溶液加于沉淀细胞中时,必须一滴滴地缓慢加入,同时将离心瓶置于冰浴内,以免DMSO溶液产生潜热,损伤乃至致死细胞。甘油和DMSO均应为分析纯试剂。甘油用高压灭菌,DMSO用滤器过滤除菌,两者均分装于小瓶,紧紧加塞后保存于普通冰箱内,不宜多次开启,以免形成有毒的氧化产物。(2)装瓿和封口:将上述细胞悬液分装于1ml的硬质玻璃安瓿内。在距细胞悬液面3cm处用酒精喷灯封口，以免烫死细胞。封口必须十分可靠，否则在由液氮中取出时可能发生危险的爆炸。因此，应将已经封口的安瓿置入05％甲基蓝溶液中10分钟。凡有蓝色液进入的安瓿应即废弃，并将合格的安瓿置自来水下冲净后擦干，准备冷冻。(3)冷冻：将细胞安瓿置于特制的预冻装置内，使其温度缓慢下降(每分钟1℃)直至-20℃。此后即可将其迅速置液氮中。如果没有特制的预冻装置，可将细胞安瓿放入一个适合的纸匣内，衬垫棉花加以固定，切勿倾斜。匣外包裹3层棉花，每层厚1cm，再用橡皮带扎紧,随即置4℃冰箱内6小时，取出后置入-20℃冰箱内24小时。在由-20℃冰箱内取出后，迅速除去棉花层，并从匣内取出安瓿，立即浸入液氮保存。液氮罐由低温合金钢制成，配有提壶。在灌入液氮后，即可将提壶直接浸入液氮内。为防止安瓿漂浮，可在安瓿上放一些玻璃珠压住。当液氮罐内的液氮蒸发过半时，即需加灌新的液氮。根据液氮罐的容量和使用情况，例如开启的频度等，一般每15～25天加灌一次新的液氮。由于液氮罐内不断逸出氮气，故应将其置于通风良好的房内。(4)复苏和培养：需取用细胞时，可用竹镊子取出细胞安瓿，迅速投入37～40℃的水浴锅内，加盖并适当摇晃，使冰冻的细胞迅速融解(40～60秒内)。随即取出已融化的细胞安瓿，用75％酒精消毒后，用安瓿锯锯开颈部，用几层灭菌纱布掰除安瓿顶部后，用毛细吸管吸出细胞悬液，置入培养瓶，并于每ml细胞悬液内加入10倍量预热至37℃的营养液。营养液中的血清含量提高至10%～15％。置37℃的CO2温箱内培养4～12小时。在细胞贴壁后，即可换入新的营养液，继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。也可在细胞悬液内加入10倍量营养液后，即以500r/min的速度离心沉淀10分钟，倾弃上清层，彻底除去保护剂，再在沉淀细胞内加入营养液，充分混悬后分瓶培养。营养液的最后加入量以原培养的细胞营养液为准。例如由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮在10ml营养液中进行培养。如果低温保存条件不理想，例如冷冻速度不够缓慢……等等，则因细胞死亡较多，最后的营养液量可减半。细胞计数时，每ml营养液中的活细胞不应低于20～30万。如果没有液氮设备，可将上述已经预冻处理的细胞安瓿置-70℃冰箱内。在液氮中保存1～2年的细胞，活存率一般可达80%～90％，而在-70℃冰箱内保存同样时间的细胞，活存率不到10％，有时只有3％左右。液氮操作必须十分小心,应穿戴防护服、面罩和手套，特别注意防护眼睛。没有封严或有裂纹的安瓿中可能渗入液氮，当由液氮中取出时，因液氮快速蒸发而发生剧烈爆炸。皮肤接触液氮也会引起严重冻伤。近来改用塑料安瓿，就比较安全了。
〖JZ〗附：细胞培养物中支原体的消除〖HT〗支原体是组织培养中最常见的污染微生物，但因组织培养液中的支原体即使高达每毫升106～108个菌落形成单位(CFU/ml)的浓度，通常仍不引起严重的细胞病变，组织培养液也不明显浑浊。因此，支原体污染又是一个常被忽视的问题。然而必须指出，组织培养液中大量支原体的存在和增殖，必然大量消耗营养液中的营养成分，特别是氨基酸，如精氨酸等，这就间接地影响细胞的生长和增殖，甚至导致细胞退行性变化。据某些学者统计，原代细胞培养物的支原体污染率为1%～3％，而继代细胞株和传代细胞系中的支原体污染率高达45%～92％。这可能是支原体在传代培养过程中大量增殖的缘故。组织培养细胞中的支原体，既有细胞源性的，也就是由细胞本身带来，但更可能来自毒种、动物血清甚至胰酶，也有来自操作人员口、鼻和手的污染。迄今尚无消除组织培养细胞内支原体污染的简单有效方法，学者们推荐了一些方法，例如：(1)抗生素处理，常用的药物有聚对内稀茴香醚、卡那霉素、金霉素、四环素、泰乐霉素、新生霉素、庆大霉素、磺酸盐以及5〖DK〗溴尿嘧啶等；(2)进行细胞克隆(见细胞克隆技术)，但在克隆前要将污染细胞用抗生素处理并作较高倍数稀释后传代培养，维持液中同样应含有抗生素，如上连续传代3～4次后，进行细胞克隆；(3)向培养液中加入特异的抗支原体高免血清，可同时与抗生素联合使用；(4)在41℃温度连续感作18小时；(5)共生培养，与巨噬细胞共培养以去除支原体。上述方法能在一定程度上降低组织培养细胞内的支原体滴度，但常难以彻底清除。而在实施这些试验之前，又需先作大量细致的预备试验，例如测定组织培养细胞能否耐受41℃18小时的感作处理;测定组织培养细胞能够耐受的抗生素浓度;了解抗血清的加入是否影响细胞的生长和增殖等等。综合应用上述方法，例如于营养液内同时加入卡那霉素(100～200μg/ml)和高免疫血清(其在营养液内的最后浓度为5％)，效果似乎更好一些。通常是在每代培养物中加药，每周传代一次，连续4周。毒种、血清和胰酶等也应预先处理。毒种可用大量抗生素处理，即在每ml毒种内加入1mg的卡那霉素或200～500μg的金霉素或四环素。血清以56℃30分钟灭活，必要时再用孔径为01μm的滤膜或滤板过滤；胰酶也作这样的滤过处理。刘洪等1992报道，应用BM-Cyclin(一种抗生素)和MRA(MycoplasmaRemovalAgent)处理10个污染支原体的细胞系，效果显著。一个处理过程即可全部去除细胞中的支原体。处理后的细胞形态正常，生长快，且提高了对病毒的敏感性。检测组织培养物中的支原体，主要应用培养法，即取1ml组织培养液或01ml细胞悬液加入10ml支原体液体培养基内，37℃培养1周，此时培养基可能因支原体生长而变色或稍呈现浑浊，即可转种于4个支原体固体培养基平板上。将其中2个平板置普通温箱，另2个平板置5％CO2温箱中，37℃孵育2周后检查支原体菌落。支原体菌落极小，直径在50～500μm之间，难用肉眼清楚看到，故常需用100×左右的低倍显微镜观察。支原体菌落中心致密，边缘较薄，呈油煎鸡蛋样。
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