病毒的组织培养
组织培养是病毒学研究和实践中最为广泛应用的手段，不仅用于分离和鉴定病毒，而且是研究病毒与机体或组织细胞相互关系的基础。且如上述，组织培养细胞还是生产特异性诊断抗原和病毒疫苗的比较理想的材料。应用组织培养细胞接种病毒，必须首先选择敏感细胞。例如乙型脑炎病毒易在仓鼠肾、猪肾、羊胚肾和鸡胚等原代细胞上增殖，并常呈现明显的细胞病变或出现蚀斑；狂犬病病毒可在鸡胚、小白鼠、仓鼠、猪、兔、狗等许多动物和人的许多组织的原代细胞和继(传)代细胞中生长，但在WI-38(人胚肺二倍体细胞株)、BHK〖DK〗-21克隆13和小鼠成神经细胞瘤细胞(C-1300)中产生的病毒滴度最高，并形成明显的细胞病变；马传贫病毒只能在马属动物的原代白细胞和骨髓细胞以及某些继代或传代细胞内增殖……等等。应用组织培养方法培养病毒，一般采用易感动物的组织，例如应用牛、猪或仓鼠的细胞培养口蹄疫病毒，应用马属动物的细胞培养马传贫病毒等等。但是非敏感动物的组织细胞有时也能支持自然条件下不感染的病毒的生长，例如可用鸭胚细胞培养鸡的马立克氏病病毒等等。关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。故在分离未知病毒时，应该多选几种细胞同时进行分离培养，以便增加分离成功的机会。而病毒的细胞感染范围又可反过来为该病毒的分类鉴定提供一定的依据。病毒学专著中在论述病毒特性时，一般都将介绍各该病毒的感染细胞范围，本书“病毒学各论”中也将提供这方面的资料。某些病毒的分离培养特别困难，器官培养可能是比较有效的一个方法，例如一些新的呼吸道和肠道病毒，就是通过这个途径分离获得的。当病料污染严重或含有的活病毒量太少，直接用细胞培养分离病毒困难时，可采用“带毒培养方法”。即先用病料悬液接种健康同种动物或易感实验动物，当其出现可疑症状时扑杀，立即灭菌采取可能感染有病毒的组织器官进行原代细胞培养，经48～72小时细胞基本长成单层时换维持液，以后每天镜检细胞病变(CPE)一次。这种带毒培养的细胞，往往于原代即能出现CPE。为提高病毒分离率，当原代培养没有出现明显CPE时，可将原代细胞盲目进行次代培养，有时原代细胞未出现CPE或CPE不明显，而于次代培养时出现。另外，这种方法也可用于已知病毒的培养传代，即在病毒传代过程中发现CPE不明显或不规律时，可将此带毒培养物用胰酶消化后作1∶1或1∶2传代培养，往往在带毒传代以后，病毒对细胞的毒力表现增强，CPE恢复正常。以上两种带毒传代方法，在我们实验室都曾多次应用，实践表明，效果良好。关于细胞培养物接种病毒的时机，多数病毒是在细胞培养长成或基本长成单层后，在换液同时接种病毒；但细小病毒类例外，要在培养细胞同时接种病毒。原因在于这类病毒复制过程中编码能力有缺陷，需要依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能才能完成病毒粒子的复制，因此需要与细胞传代时同步接毒。必须指出，组织培养细胞，特别是原代细胞和由原代细胞传代育成的细胞株，往往自身携带病毒，易被误认为是欲分离的病毒，从而造成错误结论。因此，用以培养病毒的组织培养细胞，特别是细胞株，必须严格鉴定，并多设置空白对照，也就是不接种病毒或可疑材料作为对照。病毒在组织培养中的增殖，可以根据其所引起的细胞病变、细胞代谢(颜色)反应或者血凝素和特异性病毒抗原等病毒成分以及电镜直接观察而识别。将感染培养物接种敏感动物和鸡胚，观察实验动物和鸡胚的发病和死亡情况以及病理变化，也是判定致病性病毒存在的一个常用方法。某些病毒之间存在干扰现象，也就是一种病毒的增殖可以抑制另一种病毒的生长，因此可以应用一个已知病毒，根据其在细胞培养物中的被干扰情况，间接判定另一种病毒存在的可能。也有一些病毒具有增强另一些病毒增殖和产生细胞病变的作用，所以也可利用这一现象判定这些病毒的存在等等。
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