病毒蚀斑技术
病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。因此可用蚀斑方法进行此类病毒的检测。混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU……等等。病毒蚀斑技术的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。例如在接种02ml病毒悬液的细胞瓶中出现36个蚀斑，则每ml病毒悬液的蚀斑形成单位就是1/02×36=180个，亦即180PFU/ml，当然也可写成36PFU/02ml。蚀斑技术主要用于病毒纯化，亦即挑选病毒克隆株(Clone)。由于病毒的遗传变异，一般所用的病毒悬液或所谓的病毒株，实际上都是由许多在特性上不尽一致的病毒粒子组成的混杂群体。应用蚀斑技术，也就是根据蚀斑的不同的性状、产斑条件和产斑时间等进行挑斑，可以从这类混杂群体中挑选出各个不同的纯化病毒，亦即克隆株。近年来，许多弱毒疫苗株就是通过蚀斑技术选育而成。我们实验室应用蚀斑技术从狂犬病弱毒株中，分离获得了免疫性显著优于其亲本株的SRV9克隆株。而在弱毒疫苗的生产中，也需经常地通过蚀斑技术选出克隆株，借以保证疫苗株稳定的免疫原性和弱毒特性。蚀斑技术还是测定病毒悬液中感染病毒含量的一个准确方法。因为组织培养细胞的敏感性比较一致，培养条件也易统一，所以蚀斑技术已在许多动物病毒的滴定中取代了实验动物滴定法。由于特异性抗体能够抑制病毒产生蚀斑，故可应用蚀斑技术测定动物血清或其他体液内的中和抗体，亦即所谓的蚀斑抑制试验和蚀斑减数试验，详见本书第十四章。目前应用的蚀斑技术，主要有单层法和悬浮法，现分别介绍如下。〖HT4SS〗〖JZ〗(一)单层法〖HT〗单层法是目前最常应用的一种方法，多用于病毒克隆化(挑斑)以及病毒毒力的滴定。此外，病毒遗传变异研究以及蚀斑抑制或蚀斑减数试验等血清学技术亦在此基础上进行。主要步骤如下：(1)先将敏感细胞在培养瓶或平皿内培养成单层。如果有CO2温箱，使用24孔培养板更为方便，当然也可使用平皿。蚀斑试验时的细胞接种量要大，通常为每ml200～400万个细胞。(2)倾弃或吸弃营养液，加入Earle氏洗液冲洗单层细胞，或者加入不含血清的维持液——pH74～76的05％乳白蛋白水解物Earle氏液，37℃浸泡一小时后倾弃，洗去脱落的死亡细胞，并可将细胞间隙中残留的血清充分洗出，以减少血清对某些病毒可能有的非特异性抑制作用。(3)以不含血清的维持液(脑炎类病毒可用灭菌的10％脱脂牛乳生理盐水)将病毒作连续的10倍稀释，选择适当稀释度的病毒悬液接种培养瓶或孔内的单层细胞，接种量约为原营养液的1／10～1／20，每个稀释度至少接种3瓶(或孔)。置37℃感作1～2小时，使病毒充分吸附。某些病毒的吸附较慢，可将感作时间延长到2小时以上。吸附完毕后，吸出病毒液。有人建议再用Earle氏液或无血清维持液洗涤细胞一次，作者认为并不十分必要，特别是对抵抗力低的病毒，因为未吸附的病毒将在37℃培养期间自行灭活。(4)取含中性红的营养琼脂糖(配制法见本节附录)，融化后降温至43～45℃,注入细胞培养瓶内无细胞的一面，再将培养瓶缓慢翻转，使营养琼脂糖覆盖在细胞表面，厚度约2mm，以不超过3mm为宜。平放30～60分钟，待琼脂糖凝固,随后置37℃继续培养。由于中性红是光动力活性染料，遇光时产生对病毒呈现毒性作用的物质。故将中性红营养琼脂糖注入细胞培养瓶后，应立即用黑纸或黑布盖住，置37℃培养时也要放在暗匣内避光，此后逐日观察一次细胞形态以及出斑情况,见图11-2。〖JZ〗图11-2狂犬病毒Flury株在BHK〖DK〗21细胞上的蚀斑(左),右为健康对照〖JY,8〗自岳军明某些病毒的出斑时间较晚，例如马传染性贫血病毒的蚀斑实验，可以采用双层琼脂糖法，即在给单层细胞接种病毒后，先覆盖第一层不含中性红的营养琼脂糖，5～6天后，再加入内含中性红的第二层营养琼脂糖层，继续培养(避光)，并逐日观察细胞形态和出斑情况。作者等的具体方法是：取已长成单层的驴胎继代细胞，倾弃营养液，接种适当稀释的病毒液(细胞培养毒)，例如10-3、10-4、10-5，每个培养瓶接种05ml(10ml培养瓶)，37℃感作2小时，吸弃残留的病毒液，加入融化并冷却至43～45℃的第一层琼脂糖8ml(见本节附录)，逐日观察细胞。于第6～7天，当细胞开始出现粗糙现象时，加入内含中性红的第二层琼脂糖(见本节附录)，每瓶3～4ml,置暗匣内继续培养，第2～3天后即可出斑。出斑数与病毒液的浓度基本相符。对出斑时间较迟和中性红敏感的病毒，覆盖层中不加中性红，而根据病毒的出斑时间，在培养后的适当时机，单独应用中性红溶液染色，同样能获得轮廓清晰、形态规整的蚀斑。〖HT4SS〗〖JZ〗(二)悬浮法〖HT〗悬浮法主要用于不能增殖的细胞，例如血液或腹腔巨噬细胞等等，但也有人用于其它可以分裂增殖的细胞。悬浮法不宜用于大型病毒，因为这类病毒在琼脂糖中不易扩散。(1)先在培养瓶或平皿底部覆盖一层营养琼脂糖，使其形成2mm厚的底层，待其凝固；(2)根据细胞种类，用无血清维持液稀释成适当浓度的细胞悬液，例如Vero细胞和BHK细胞可用每ml600万个细胞的浓度，原代仓鼠肾、鸡胚细胞和巨噬细胞可用每ml1000万个细胞的浓度；(3)吸取上述细胞悬液，置灭菌试管中，每管16ml，再加入无血清维持液稀释的(例如10-3～10-8)病毒悬液04ml，每个稀释度最少接种3管；(4)充分振荡混合后置37℃温箱内感作30分钟，并定期振荡；(5)每管加入等量(2ml)的43～45℃营养琼脂糖，迅速混匀后倒入培养瓶(10ml培养瓶)内的底层琼脂上，平放待其凝固；(6)根据各种病毒可能的出斑时间，于3～4天或更长一些时间后加入4～5ml001%中性红溶液(见本节附录)，37℃感作一小时；(7)吸弃多余的中性红溶液，观察蚀斑。如果还未出斑，可将培养瓶继续置暗匣内培养，直至出现清晰的蚀斑。利用悬浮法挑斑，同样也可在24孔细胞培养板上进行。〖HT4SS〗〖JZ〗(三)挑斑法〖HT〗为了分离病毒克隆株，在培养瓶内出现清晰的蚀斑时，即可进行挑斑。最好选择蚀斑数较少，各斑间的距离不小于10mm的培养瓶。先在选定的蚀斑部位的瓶壁上做好标志，随后应用带有橡皮乳头的弯头吸管直接吸取选定的蚀斑——连同琼脂糖一起。如系平皿内的蚀斑，则可直接用吸管吸取之。将吸取的蚀斑琼脂糖洗入05～1ml营养液内，反复冻融三次，使病毒充分释放，用之接种敏感细胞,待其充分增殖以后，考虑再作下一轮的蚀斑纯化，并挑斑。如此操作三次，一般可达到纯化目的。〖JZ〗〖HT4H〗附录
1.琼脂糖〖HT〗是从琼脂中去除对细胞有毒性作用的琼脂胶后,精制出的一种线性多糖。它对细胞既无毒性,又能形成透明的半固体状态,有利于挑斑,所以是蚀斑技术常用的覆盖物。以各厂家生产的琼脂糖配制的凝胶硬度不尽相同,实践中可以适当调整其含量。此外,甲基纤维素也很好,但由于它制备的覆盖层呈半液体状态,虽适于病毒的毒力滴定和中和抗体检测,但用于病毒克隆则比较困难,不好挑斑。〖HT5H〗2.中性红〖HT〗各厂家生产的中性红的质量明显不同,即使同一厂家生产的不同批号的中性红,质量也不一致。因此必须通过对比试验,慎重选用同一批号的产品。保存时还应避光、避热、避潮。保存多年的中性红,质量下降,似乎还增高毒性。配制1∶1000或1∶10000中性红溶液时,可将中性红粉直接溶于去离子水配制的085%NaCl液中。8磅高压灭菌,使其彻底溶解,无菌分装于褐色瓶内,置4℃冰箱保存备用。营养琼脂糖内中性红的最后浓度以1/28000～1/36000为宜。
3营养琼脂糖〖HT〗根据细胞和病毒种类的不同,选择下列某一种营养琼脂糖。鸡胚原代细胞一般用05%乳白蛋白水解物-犊牛血清营养琼脂糖,作痘病毒和脑炎病毒的蚀斑试验,常能取得满意结果。哺乳动物肾细胞、二倍体细胞和传代细胞则常应用以199或E〖CD*2〗MEM等配制的营养琼脂糖。(1)05%乳白蛋白水解物-犊牛血清营养琼脂糖:首先配制乳白蛋白水解物琼脂糖,取:〖WX(!31KG5,3YQ〗Earle氏液(10倍浓缩,不含酚红和碳酸氢钠)〖〗18ml〖〗乳白蛋白水解物〖〗09g〖〗琼脂糖〖〗12g〖〗去离子水〖〗140ml〖WX)〗将上述各成分混合,煮沸溶解,然后分装小瓶,8磅高压灭菌15分钟,4℃保存备用。用前将其置于沸水浴中加热融化,待温度降至43～45℃时按下列比例配成营养琼脂糖:〖WX(!31KG5,3YQ〗乳白蛋白水解物琼脂糖〖〗80ml〖〗犊牛血清〖〗45ml〖〗1:1000中性红溶液〖〗25ml〖〗75%碳酸氢钠溶液〖〗25ml〖〗青、链霉素溶液(每ml分别含青、链霉素1000单位)〖〗08ml〖WX)〗配好后,振摇混合,置43～45℃水浴中保温备用。如此配制的营养琼脂糖的pH为72～74,应呈红黄色,必要时适当调整pH。(2)E〖CD*2〗MEM犊牛血清营养琼脂糖I:先将E〖CD*2〗MEM配成2倍浓度的使用液,再在无菌条件下以NaHCO3液调整pH至74,加温至43～45℃。按下方加入各成分:〖WX(!31KG5,3YQ〗2倍浓度的E〖CD*2〗MEM(以不含酚红的Earle氏液配成)〖〗100ml〖〗1:1000中性红溶液〖〗6ml〖〗犊牛血清〖〗4ml〖〗2%琼脂糖(以去离子水配成,pH为74,高压灭菌备用)〖〗100ml〖〗青、链霉素溶液〖〗2ml〖WX)〗充分混合后应用。(3)E〖CD*2〗MEM犊牛血清营养琼脂糖II:首先按下列配方配制成2倍浓度营养液:〖WX(!31KG5,3YQ〗10倍浓度的E〖CD*2〗MEM(用不含酚红的Earle氏液配成)〖〗20ml〖〗3%谷氨酰胺〖〗2ml〖〗犊牛血清〖〗36ml〖〗88%碳酸氢钠溶液〖〗5ml〖〗青、链霉素溶液〖〗2ml〖〗去离子水〖〗644ml〖〗1∶1000中性红溶液〖〗3ml〖WX)〗另取2%琼脂糖(配法同前),水浴融化后保持于43～45℃,加入等量已加温至43～45℃的上述2倍浓度营养液,充分混合后保存在43～45℃中待用。(4)双层营养琼脂糖:包括不加中性红的第一层琼脂糖和加中性红的第二层琼脂糖。〖ZZ6〗第一层琼脂糖〖WX(!31KG5,3YQ〗05%乳白蛋白水解物Earle氏液配制的08%～1%琼脂糖(不含酚红)〖〗45ml〖〗犊牛血清〖〗6ml〖〗75%碳酸氢钠溶液〖〗09ml〖〗3%谷氨酰胺〖〗1ml〖〗青、链霉素溶液〖〗06ml〖WX)〗混匀后置43～45℃水浴保温备用。〖ZZ6〗第二层琼脂糖〖WX(!31KG5,3YQ〗05%乳白蛋白水解物Earle氏液配制的08%～1%琼脂糖(不含酚红)〖〗30ml〖〗75%碳酸氢钠溶液〖〗14ml〖〗1∶1000中性红溶液〖〗26ml〖〗犊牛血清〖〗3ml〖〗青、链霉素溶液〖〗04ml〖WX)〗混匀后置43～45℃水浴保温备用。
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