负染色也叫阴性反差染色。这种染色法是用重金属盐类溶液与样品混合而使样品呈现出良好的反差。经这种方法染色的生物样品，在电镜下是暗背景下的亮物像，与通常的染色性质相反，所以称之为负染色。负染色原理尚待进一步探讨，一般认为是用电子散射力强的重金属衬出电子散射力弱的物体的像。染色后，染液在病毒的疏松处或空隙处滞留，因而在电镜下病毒的这些部位呈黑色，或者染液将病毒包围，病毒周围的背景呈黑色，病毒本身因电子散射力弱而较透明，如图12-6。早在五十年代,Hall和Huxley等即已应用这种方法于生物大分子的研究，后来由Brenner和Horne等改进成常规方法，并应用于病毒的研究，对病毒学的发展起了相当大的推动作用。它不仅是研究病毒结构的好方法，而且已广泛用于临床病毒学诊断。就某些病毒性疾病来说，根据病毒的形态特征，结合患病动物的临床症状，即可获得比较肯定的诊断。依据病毒粒子大小、形态和对称性而能作为定性诊断的有腺病毒科、疱疹病毒科、呼肠弧病毒科、冠状病毒科、小RNA病毒科、细小病毒科和痘病毒科等等。 负染色的主要特点是反差强，分辨力高，可以看到病毒的亚单位结构，图12-7是负染色法看到的轮状病毒。负染法操作简便易行，不需特殊设备，且可在较短时间内得出结果。 图12-6 负染色密度反差原理示意 图12-7 负染法看到的轮状病毒 (横杠＝100nm)——作者原图 负染色使用的染液有磷钨酸、磷钼酸、硅钨酸和醋酸铀等。实验证明，pH68的2％磷钨酸溶液适用于多种病毒，使用范围大，因此是最常用的一种染液。具体配制方法：用蒸馏水配成2％的磷钨酸溶液，以1mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾调整pH为68，滤过后盖紧瓶盖，4℃贮藏，可长期使用。 被观察材料最好是比较纯净的病毒悬液。感染细胞培养物需反复冻融三次以上或用其它方法使细胞裂解，释放出病毒粒子。然后3000r/min离心沉淀30分钟除去细胞碎片，以上清液制片。粪便或组织可加适量缓冲液制成匀浆后，3000r/min离心沉淀30分钟取上清液制片。粘液性粪便，如果预计是能够抵抗有机溶剂的病毒，如细小病毒科和呼肠孤病毒科(轮状病毒)，则可在粪便内按1∶1容量加入氯仿或乙醚，充分振荡15分钟后，3000r/min离心沉淀15分钟，取上清液制片。水泡液、尿液、气管洗液和脑脊髓液等液体样品在低速离心沉淀后，取上清液直接制片。 如果液体内的病毒粒子含量太少，不易直接制片检出，则可应用上述制备的上清液作100000g1小时离心沉淀，倾弃上清，将沉淀悬浮后制片。 染色方法分悬滴法和喷雾法。 1.悬滴法 用毛细管吸取少量病毒悬液，直接滴在有支持膜的网上，悬液在网上呈半球形。数分钟后，用一片干净滤纸从网边吸去液体。稍干后用另一毛细管吸一滴染液滴在网上染色数十秒至1分钟左右。用滤纸吸去染液，立即进行电镜观察或置干燥器内短期保存。 2.喷雾法 将染液与病毒悬液等量混合后，在无菌柜或防尘罩内用喷雾器将样品喷到带膜的载网上。由于雾点较小，常能获得良好的效果。这种方法的缺点是容易造成病毒扩散。此外，病毒与染液混合时要求溶液的缓冲条件较高，否则可能产生沉淀而影响效果。 染色时应注意下面几点： (1)悬液内的被检病毒要有一定的浓度，太稀和太浓都不易观察，一般要求以106～1010个病毒粒子/毫升较好。 (2)不同的病毒可用不同pH的染液试染。 (3)染液的浓度与染色时间应视样品的不同而异。大而疏松的样品，浓度应低些，染色时间短些；小而致密的样品，染液浓度应适当高些，染色时间长些。一般情况下，游离病毒粒子用2％磷钨酸染色的时间为1分钟左右，某些小型病毒可延长些。 (4)支持膜特别是碳膜呈疏水性，需要时可在悬液内加数滴0005～005％牛血清白蛋白或04％蔗糖等扩散剂，使被检材料和染液均匀地散布在网上。 (5)用滤纸吸去病毒悬液后，要在肉眼看不出载网上残留液体时立即滴加染液，否则样品与染液易形成团块状，影响微细结构的观察。 (6)不同的染液可能会选择性地显示样品的不同结构，所以对每一样品应使用几种染液试验，选择最好的染液使用之。 (7)染色后要及时观察或干燥保存。 (8)观察时要先用较暗的光斑照射1～2分钟，再逐渐用强光照射，避免出现支持膜破裂或收缩等现象。 (9)制备每个样品后，要将夹过铜网的镊子通过火焰或其他方法彻底清洁，防止不同被检材料相混。
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