金属投影和复型-电镜样品的基本制备技术
录入时间:2009-6-25 17:10:01
来源：青岛海博
金属投影技术和复型技术的共同特点是采用真空喷镀仪将某些重金属物质加热到熔点以上，形成极细小的颗粒投射到样品上，产生电子反差。 金属投影技术主要用于微颗粒状生物样品，如细菌、病毒、原生动物、孢子、分离的微纤丝、蛋白质分子、核酸分子等；复型技术与金属投影技术有着密切的关系，在扫描电镜应用前，该法是唯一的一种能用透射电镜观察样品表面结构的制样方法。它多用于骨骼、牙齿以及微粒生物样品等研究。复型法最大优点是由于应用透射电镜观察复型结构，其分辨率比扫描电镜高得多。 1.金属投影 金属在真空中蒸发时，金属粒子将呈直线向四周喷射。如果在与喷射源成一定角度的地方放一物体，那么，物体朝向喷射源方向的一面将沉积一层金属粒子，而背向喷射源的一面，由于物体的阻挡，无金属粒子沉积。电镜观察时，沉积金属的一面增加了物体对电子的散射，从而增大物象的反差。这与光线照射物体形成影子相同，故称之为投影法。投影法常用于观察病毒和核酸分子等的形状和大小，除可直接测出物体的长度和宽度外，尚可计算出其高度，如图12-8。 图12-8 金属投影 h＝LtanQ 式中：h为被检样品的高度；L为影长；θ为投影角。 应用投影法要注意下面几点： (1)投影用金属：对投影用金属的要求是电子散射力强，粒子小，易蒸发，化学稳定，在电子束轰击下不粒化。用于投影的金属甚多，常用铬、铂、金、铂钯合金等。铬易蒸发，但粒子大，约6nm。铂密度大，化学稳定，电子轰击下不粒化，粒子小，约25nm，但蒸发难。铂钯合金(3∶1～4∶1)易蒸发，粒子小，约25nm，但电子散射弱，在电子轰击下易粒化。高倍放大的样品一般应用铂或铂钯合金投影；低倍放大的样品，可用铬投影。 (2)投影角的选择：投影角应根据样品的大小选择。核酸分子等线状物或小型病毒用较小的角度，如tanθ＝1/10～1/15；大型病毒则可用较大些的投影角，tanθ＝1/5～1。 (3)投影金属量的确定：可先用不同量的金属投影，找出合适的量。以后投影时，放置一定量的金属，蒸发完为止。 (4)真空度：真空度愈高愈好，一般需133322Pa(10-5 mmHg)。在较低真空度的条件下，金属粒子易与气体分子碰撞，落入阴影区后降低反差。 投影法的优点是制成的样品反差高，物像具有立体感。缺点是分辨力低。 2.复型 如前述，在扫描电镜应用之前，复型技术是唯一的能用透射电镜观察样品表面结构的制样方法。自扫描电镜问世后，虽然应用扫描电镜能够直接观察样品的结构，但是复型技术仍有它的独到之处：①对于大块不可分割的样品或是不易作前处理或易受电子束损伤的样品必须用复型法制备；②复型法制备的样品可用透射电镜观察，其分辨率比扫描电镜高。 所谓复型，就是将样品的表面结构复制下来，为了增强样品的反差，往往进行金属投影，用透射电镜观察复型膜，图像富有立体感。制样方法简便且不损伤样品，其方法有以下几种： (1)一级复型 该法通常是用05～1％火棉胶醋酸戊酯或05％Formvar氯仿溶液滴在样品上，待挥发后，在样品表面形成一层薄膜，然后将样品放入蒸馏水中，通过水的浮力将薄膜与样品分开或用化学试剂溶掉样品，用蒸馏水清洗复型膜，将复型膜打捞在载网上，金属投影和喷碳，电镜观察(图12-9)。此复型的分辨率可达2～5nm，其缺点是剥离时容易变形且难与样品分离。 图12-9 一级复型 (2)预投影一级复型 该法直接在样品表面上进行金属投影和喷碳，形成碳复型膜，再用化学试剂溶掉样品，复型膜经蒸馏水清净后，将其打捞在载网上，电镜观察(12-11)。 图12-10 预投影一级复型 (3)二级复型 先用比较厚的有机材料制成样品的一级复型，剥离后以此为模板，经金属投影及喷碳后制成二级复型，再用有机溶剂溶掉一级复型，留下二级复型，此为负复型(图12-11)。常用的是醋酸纤维素纸(AC纸)——碳复型法，该法是先清洁样品表面，然后滴上少量醋酸甲酯，将适宜大小的AC纸(厚度002～003mm)贴上去，样品表面结构就印在了AC纸上，再将AC纸印有样品结构的面朝上，进行金属投影和喷碳，制成二级复型膜，用醋酸甲酯溶液溶掉AC纸，留下的复型膜用丙酮和蒸馏水多次清洗，将其打捞在载网上即可观察。 图12-11 二级复型 (4)拟复型和微粒复型法 该法常用于微粒材料研究。将颗粒材料制成悬浮液，用微量喷雾器喷到刚剥开的云母片上，干燥后进行金属投影和喷碳，以斜方向将云母片插入10％丙酮水溶液中，其复型膜就漂浮在液面上，用载网打捞后就可进行电镜观察，将此称为拟复型法。如果将微粒物质腐蚀掉，就得到该微粒的复型膜，故此称为微粒复型法(图12-12)。 图12-12 微粒复型
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