扫描电镜样品的制备
扫描电镜(SEM)具有分辨率高和景深长等特点，因此图像层次丰富，立体感强，能够显示细胞和组织的三维结构形貌(图12-13)，因此广泛应用于生物样品表面及其断面微细结构的观察。 自1966年第一台商品SEM诞生以来，发展一直很快，仪器本身性能如分辨率和多功能等不断提高外，样品制备技术也不断地改进和完善。样品制备的质量是直接决定SEM能否发挥最佳性能，并拍出理想图片的关键所在。考虑到生物样品质地柔软、容易变形、导电性差、二次电子发射率低以及含水量多等特点，在制备SEM样品时，必须掌握以下原则： (1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构； (2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免样品体积变小和收缩变形等人工损伤； (3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应； (4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面。 SEM样品的制备过程如下：①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左右。②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态，但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。③固定 用25～5％戊二醛固定30分钟或更长时间。Boyde建议用戊二醛固定几天到几个月，这样会增加组织的韧性，减少脱水造成的萎缩。④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。⑤重固定 1％锇酸固定1～2小时。⑥漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。⑦脱水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％丙酮或乙醇溶液各10分钟，大于1mm的样品可脱水10～20分钟。⑧干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或45℃热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。 a.临界点干燥法原理：在干燥过程中，表面张力会使样品变形。因此，为了保持样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国内外都有商品临界点干燥器。照理，含水样品可以直接进行临界点干燥。可是，由于水的临界温度高达374℃，临界压力高达247×10６Pa(218个大气压)，这样高的温度和压力不仅会破坏样品的形态构造，而且需要耐压很高的仪器。解决这个问题的办法就是选择临界温度接近室温，临界压力接近大气压的液体取代样品中的水，然后对这种液体进行临界点干燥，使样品达到干燥的目的。这种液体叫做转移液。对转移液的要求，除要求其适当的临界温度和临界压力外，还应考虑其毒性、密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体CO2。b.临界点干燥法的过程：脱水前的处理同空气干燥法。中间液替换：因为样品要从脱水剂(丙酮或乙醇)经中间液过渡到转移液。因此，中间液既要和脱水剂互溶，又要和转移液互溶。具体步骤是：脱水后的样品在70％乙醇(或丙酮)与30％醋酸异戊酯混合液中浸10～20分钟，然后再在30％乙醇(或丙酮)与70％醋酸异戊酯混合液中浸10～20分钟，而后用100％中间液(醋酸异戊酯)浸两次，每次各10～20分钟。转移液替换：用CO2作转移液替换中间液的过程，是在封闭的耐压室内进行的。用酒精或丙酮清洗临界点干燥器的进气管道和耐压室，吹干后，反复1～2次放入和排出液体CO2，然后在耐压室底部放数层滤纸，并将装有样品的样品架放入。拧紧耐压室盖，慢慢放入液体CO2。然后稍开排气阀，以5L/min的流量排出耐压室原来的气体，此时可闻到醋酸异戊酯味，待醋酸异戊酯味消失后，关闭排气阀。此时通过观察窗观察室内液体CO2应浸没样品(如果不能浸没样品，说明耐压室温度高，应降温后再行操作)，关 闭进气阀，停放约1～2小时以完成CO2的置换过程。此时压力约为56×１０6～64×１０6Pa(57～65Kgf/cm2)。加热：用60℃温水或自动调温装置将耐压室加温，压力很快增加，使压力维持在11×１０７Pa(110Kgf/cm2)左右。5～10分钟，CO2全部汽化，从观察窗可看到其汽化过程是：液面上升→界面模糊→完全混浊→透亮无液体。这时的压力约为93×１０6Pa(95Kgf/cm2)。排气：在排气管口放一温水杯，这样既可观察排出的气泡数以控制排气速度，又可避免排气管路产生干冰而造成堵塞。慢慢打开排气阀，使压力缓慢下降，并维持耐压室温度在50℃左右。排气速度不可太快，否则会损伤样品，一般控制在10泡/秒左右［约每分钟49×１０5～98×１０5Pa(5～10Kgf/cm2)的降压速度］。大约经一个多小时的排气后，压力表指示为“零”，排气口无气泡时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品。(5)导电：大多数生物样品的表面电阻很高，直接用扫描电镜观察会产生充放电效应，所以要对样品进行导电处理。常用的导电处理方法有金属喷镀法和导电染色法。金属喷镀法是将干燥后的样品用导电胶粘在样品台上，放入真空喷镀仪内旋转喷约15nm厚的碳和金，随后进行电镜观察。这种方法除可消除充放电效应外，还可提高二次电子发射率。缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形。导电染色法是用金属盐类化合物与生物体的蛋白质、脂类、糖类等结合，使表面离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子间，从而使样品表面电阻值降低，消除充电放电效应，同时在一定程度上起硬化组织的固定作用。渡部忠雄等提出下面一种方法： [ZB(][BHDWG2,WK7W] 固 定 [BHG18][GP]常 规 方 法 ↓ 丙酮脱水 ↓ ↓ 临界点干燥 ↓ 喷 镀 → ← → 观 察 → 观 察 A 液 ↓ 水 洗 ↓ B 液 ↓ 水 洗 ↓ C 液 ↓ 水 洗 导 电 染 色 法 注： A液：2%蔗糖，2%谷氨酸钠，2%甘氨酸； B液：2%鞣酸； C液：2%锇酸 在固定后脱水前用A液、B液和C液进行导电处理，使戊二醛固定后残存在样品组织内的醛基和氨基酸结合，再用鞣酸与样品组织中的蛋白质、糖和氢结合，同时鞣酸还会和浸入样品组织内的氨基酸和糖结合，水洗除去多余鞣酸后，再使锇酸与样品组织内的鞣酸螯合，这些金属螯合物具有优良的导电性能。另外，亦可把脱水后的样品浸在下述任何一种导电液中数十小时后,漂洗去掉导电液，用导电胶粘在样品台上后电镜观察。几种导电液配方如下：a.碘化钾2g＋碘02g＋重馏水100ml＋25％戊二醛10ml＋葡萄糖02g。b.15～3％硝酸银溶液(01mol/L磷酸缓冲液配制)，避光短期保存。c.溶于70％乙醇的2％醋酸铀溶液，避光短期保存。e.柠檬酸钠4g＋醋酸铅12g＋重馏水100ml，滤过后短期保存，用时加水3倍稀释。f.5％高锰酸钾(01mol/L磷酸缓冲液配制)或2～3％重铬酸钾(稍加蔗糖)。 图12-13 牛流行热病毒感染BHK21细胞的扫描电镜图像。在被感染的细胞表面有许多病毒粒子附着或“出芽” (箭头)，比例尺为100nm
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