1.离子交换捕捉
离子交换捕捉(ionexchangecapture)技术是一种纯化病毒的技术，常用于从粪便样品中纯化病毒。其原理至今不太明了，一般认为是通过磷酸氢钙(CaHPO4)的静电引力将悬浮样品中的蛋白质颗粒吸附下来，再用溶解剂EDTA将CaHPO4溶解，使蛋白质颗粒游离下来。其具体方法如下：(1)试剂的制备：①CaHPO4的制备 将03mol/L氯化钙(111gCaCl2•H2O溶解在200ml蒸馏水中)和03mol/L磷酸氢二钠(142gNa2HPO4溶解在200ml蒸馏水中)，以相同流速(120滴/分钟)分别从两个容器中流入一个盛有100ml蒸馏水的烧杯里，同时用磁力搅拌器搅拌。将粗制的CaHPO4(呈絮状沉淀)再反复4次以蒸馏水悬浮和沉淀，最后将沉淀的CaHPO4用015mol/LPBS(pH72)悬浮，保存于4℃中待用。②EDTA饱和液配制 将98gEDTA加到100ml蒸馏水中，强烈振荡，溶解后，调pH到72，置于4℃中备用。 (2)粪样处理：将采自腹泻动物的粪便，制成10～20％悬液，以1500r/min速率，离心10分钟，取其上清液约1ml，加CaHPO42滴，充分搅匀，以同样速率离心，弃上清，向沉淀中再加2滴EDTA饱合液，使CaHPO4溶解。(3)负染色：将处理后的粪便滴附在碳福尔马林膜上，用2％PTA负染后电镜观察。 经对比试验表明，此法制备样品的纯度相当于超速离心法。电镜观察结果表明，图像背景清晰，杂质少，病毒数量增多，适用于临床检验各类病毒的快速诊断。
2.高速离心
为了提高样品的含病毒量，一般采取超速离心沉淀法来实现，但此法要求超离设备，也很麻烦。经我们摸索，对于组织培养的细胞培养物或悬浮样品(包括腹泻粪便、尿液、痰、脑脊髓液、血清、水泡液、粘膜分泌物、鸡胚尿囊液、羊水等)，采用台式高速离心机，即能达到检测病毒的目的。其方法：①用吹打、超声波或冻融法等将样品中的病毒充分释放出来；②低速离心，以3000r/min速率离心15～20分钟，将大的组织物沉淀下来，取上清；③以15000r/min速率离心20分钟，取沉淀物；④用1滴蒸馏水悬浮；⑤2％PTA负染色；⑥电镜观察。
3.液相免疫电镜
液相免疫电镜(liquidphaseimmunoelectronmicroscopy)，亦即常规的抗原抗体免疫复合物法。就是抗原和相应的抗体特异性结合，形成大分子复合物或聚合物，易于沉淀，便于电镜观察。此法最常用，且简便易行。通常将一定量抗原(01～025ml)与等量稀释后的抗体混合，37℃作用1小时，高速离心，取其沉淀物，经少许缓冲液悬浮，负染后，即刻观察。本法中值得注意的是：①抗原与抗体的合适比例是关键，因为抗原或抗体过量或不足都不易形成理想的便于观察的大块复合物。为此，常用琼脂免疫扩散试验，预先找出抗原、抗体合适比例；②高速离心法可用琼脂凝胶扩散滤过法代替。方法如下：a.将滤纸叠成4～6层，一般为半个载玻片大小，用钉书机将两端平整地钉在一起，浸泡于饱和聚乙二醇(30g聚乙二醇溶于100ml水中)内约数分钟，取出后，置干燥器内防潮备用；b.制备1％琼脂糖板，将琼脂糖以pH72巴比妥缓冲液或生理盐水加热溶化，取约15ml铺于普通玻片上，冷凝后置于潮湿盒内并放在4℃备用；c.以刀片切取小块琼脂糖板，铺于聚乙二醇滤纸垫上，取1滴抗原抗体复合物悬浮液滴附在琼脂糖板上，当复合物悬液还未被全部吸收完时，用载网，膜面朝下浮于复合物液滴上，取下载网，经负染后电镜观察。此法快速、敏感度高，常用于快速诊断病毒病(图12-20)。 图12-20 貉细小病毒的液相免疫电镜图像 注意抗体桥连接的病毒粒子(箭头)，比例尺为100nm。
.固相免疫电镜
固相免疫电镜技术(solidphaseimmunoelectronmicroscopy)是将抗体固定在固相载体上，在悬浮样品中捕捉相应的抗原(病毒粒子)，以便在电镜下观察鉴定。此法优点在于图像背景较清晰，较好地除去非特异性杂质，使病毒粒子容易观察。尤其近年，将金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)应用在固相免疫电镜技术后，克服了抗血清(抗体)直接铺盖铜网膜的缺点，即使应用效价较低的抗血清，也可得出较好的效果。1979年，Shukla等首先将SPA应用于电镜检测植物病毒。以后Nicolaieff等又将其应用于轮状病毒的电镜检测。 现以检测猪轮状病毒为例，介绍固相免疫电镜检测的具体方法：一种方法是直接利用金黄色葡萄球菌菌体做固相载体。水浴加热80℃约5分钟，处理该菌使其充分暴露细胞壁上的SPA，利用它具有吸附某些动物血清中IgG的特性，使该菌表面包被一层特异性抗体。在悬浮的样品中，它就像滚雪球一样，粘附相应的抗原(病毒粒子)，便于电镜观察。该法从制样到观察，整个过程只需2小时左右，其操作步骤为：①取兔抗猪轮状病毒高免血清(抗体)用01mol/LPBS(含002％叠氮钠pH72)稀释10倍，与金黄色葡萄球菌菌体(每毫升含3×108个)等量混合并将混合液置于37℃水浴中孵育15分钟；②取1ml混合液，以3000r/min速率离心15分钟，弃上清，将沉淀物用PBS液悬浮，按同法离心2次,以除去未结合的抗体；③用1ml含病毒粪样将带有抗体的葡萄球菌再次悬浮，置于37℃水浴中，轻微振荡感作30分钟；④按上法离心2分钟，弃上清，用01mlPBS液将沉淀悬浮，并滴附在蜡盘上，用05～10％磷钨酸水溶液负染05～1分钟后，电镜观察。 另一种方法是利用铜网上的膜作固相载体，通过SPA将特异性抗体固定在铜网膜上。具体操作步骤为：①滴10μlSPA(01mg～05mg/ml)于蜡盘上,将铜网膜面向下漂浮在SPA液滴上,约1分钟；②用滤纸吸去多余的SPA；③将10μl稀释好的(1∶10倍)兔抗猪轮状病毒血清滴于蜡盘上，再将附有SPA的铜网膜面向下漂浮在血清液滴上，约1分钟；④用同样的液滴漂浮法，在蒸馏水液滴上漂浮5次，洗去抗血清中未被SPA吸附的杂质；⑤将20μl含病毒粪样滴附在蜡盘上，再将吸附抗血清的铜网膜面向下漂浮在含病毒的粪样滴上，置37℃温箱中约30分钟；⑥水洗10次，分别在PBS液滴上漂浮5次，在蒸馏水上漂浮5次；⑦负染，用2％磷钨酸染1分钟左右，电镜观察。 在固相免疫电镜操作中，作者认为下列问题值得注意：①在以金黄色葡萄球菌菌体为固相载体时，要选择含SPA丰富的菌体，此点对试验成功与否是个关键；②金萄球菌与抗血清感作后，要尽量将过剩的游离抗血清，通过反复悬浮和离心除掉，以免影响葡萄球菌对病毒的捕捉；③包被抗体的葡萄球菌与病毒粒子相作用时，要充分搅拌，使二者有足够的相互作用机会；④负染葡萄球菌时，染液浓度要低，防止浓染，否则会影响吸附在葡萄球菌周围的病毒粒子的观察；⑤第二种方法中的SPA浓度，试验证明以01mg/ml的效果最好，浓度太高会影响吸附效果；⑥两种方法中所用的抗血清都应56℃30分钟灭活，以消除非特异性反应物质(图12-21，12-22)。 图12-21 在金黄色葡萄球菌的表面吸附许多猪轮状病毒粒子(箭头)
比例尺为100nm
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
