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层析法-病毒提纯方法



录入时间:2009-6-26 9:28:09 来源:青岛海博

   病毒粒子表面携带特定的电荷群,因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种,一种是正吸附法,即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附,然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收;另一种是负吸附法,即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白,而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同,因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。
1.萄聚糖柱层析法将初步浓缩的材料,通过葡聚糖G150或G200柱层析,然后用002~015mol/L磷酸]盐缓冲液(pH76)洗脱,分部收集,测定280nm波长处的OD值,将含病毒的各部分相混合,]再浓缩,透析之后,即可得到比较纯净的病毒,Nagano(1989年)用Sephacryls1000柱层析]纯化了鸡传染性支气管炎病毒。
 [BT4]2.凝胶层析法
①     磷酸钙凝胶:这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶,由0.5mol/L]CaCl2和05mol/L]Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite”,在]碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。两者均用0001mol/L磷酸盐缓冲]液悬浮,置于4℃4~5天,使它充分沉淀后应用。
②氢氧化锌凝胶:是由7mol/L氨水与01mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH85)而制备的,在制备后数小时内较稳定,可作为吸附剂。Newton和Beris等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合,使其形成复合体后沉淀,然后用008mol/L]EDTA(pH85)解离病毒,获得较好的回收量。 
②     焦磷酸镁凝胶:是由01mol/L焦磷酸钠和01mol/L]MgCl2,以2:10(体积)比]例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合,使病毒吸附于凝胶,然后用01mol/L盐水洗2次,最后用03mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒,将病毒较好地回收于水相中。 
 3.离子交换纤维素柱层析法  离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子。通常有阴离子交换剂和阳离子交换剂两种,其主要特性见表13-1。[JZ][HT5”H]表13-1〓常用的离子交换纤维素的特性[HT6SS][]BG(!][BHDFG2,WK14ZQ,WK15ZQ,WK8ZQ,WK14W]种类[]活性基团[]性质[]作用[BHD][]二乙基氨基乙基[]强碱[][BHDWG1*3/4]阴离子交换纤维素[]氨基乙基[]中强碱[]吸附带负电荷的物质[BH][]对氨基苄基[]弱碱[][BHD][]磺甲基[]强酸[][BHDW]阳离子交换纤维素[]磷酸[]中强酸[]吸附带正电荷的物质[BH][]羧甲基[]弱酸[][BG)F][HT5SS]  某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附,通过改变平衡液的离子强度,使其再]洗脱下来而达到纯化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE纤维素吸附,可分别再用05mol/L]和015mol/L]NaCl溶液洗脱下来,从而得以纯化。  
4.亲和层析法  亲和层析是一种特殊的吸附层析,基质与待分离物具有特异的生物亲和力。通常是将特]异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配]基装成的层析柱时,即被吸附。随后再改变实验条件,将其洗脱下来,达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯,不仅纯度好,敏感,而且回收率高。Njayou(1991年)应用此法成功地提纯了麻疹病毒。他们应用猴抗麻疹病毒的IgG进行共价偶联,获得了高纯度而有活性的病毒,回收率可达总回收成份的30%。Rimmelzwaan(1987年)应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析,纯化了细小病毒,经SDSPAGE]和ELISA鉴定,99%以上的杂蛋白被洗除,收获了70%~90%的病毒抗原成份。

 

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