病毒粒子经过初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法，它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力，这种离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度(r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度g(980cm/S2)为单位来表示。离心沉淀时，沉降]速度与离心力有关。当运转角速度为ω，运转半径为R时，则：[JZ]离心力g=ω2Rav，ω=(2πr/min)/60，[JZ]g=[SX(]4πr/min2[]3]600×980[SX)]×Rav[HT5”SS][JZ]图13-2〓角转头的横剖面图[JZ]表明从旋转中心到离心管顶部、中部及底部的距离。[HT5SS] 上式中，Rav为离心管中心至转轴中心的平均距离(如图13-2)。从上式可以作]出r/min、R与g三者关系的贯线图(如图13-3)。三者中如知其二，就可推算另一数值。如转速超过7万，或R为英寸时，可参阅图13-4。[HT5”SS][JZ]图13-3〓推算转头离心力的贯线图[JZ]图13-4〓推算转头离心力的贯线图由此图可以获得与半径相关的相对离心力的值。将尺放在图左侧表示离心头中的离心管距转轴中心的距离(即旋转半径的标尺)上，]然后使之与预选转速(即图右侧的离心速度标尺)成一直线，在图中央的标尺上即可读出相对]离心力之值。图中点线表示测量一个相对离心力的例子。[HT5SS]离心机转速在4000r/min左右的称为低速(普通)离心机；转速至25]000r/min左右的]称为高速]离心机；转速25]000r/min以上的称为超速离心机。高速和超速离心机装有冷冻装置和抽]真空]装置，以保持离心腔中恒定的低温，并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和]分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用装置在一起的离心机，有的还带]扫描装置。 使用超速离心机的分离提纯方法有三种：(1)差速离心法；(2)速度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法)。
1.差速离心法
这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速)离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子大小、转速与离心沉淀时间的关系，如图13-5。[HT5”SS][JZ]图13-5〓病毒粒子大小、转速及离心沉淀时间的关系图[HT5SS]差速离心适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附释放的病毒]悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。 以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2]000～3]000r/min，20～30分钟)及中]速(10]000r/min，20～30分钟)去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。]然后，选择在60分钟内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2小时，使病毒沉淀]。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附释放后，于25]000r/min离心60分]钟，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以35]000～45]000r/min离心1～2小时。高速或超速离心沉淀物，可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲]液中。对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。 ]
2.速度区带离心法
是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不同分子形成不同的区带，而称为速度区带。该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的1/10，样品体积为离心管体积的5%。常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯净的病毒样品。病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、形状及比重，也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯度范围从5%～20%：10%～60%。蔗糖浓度梯度离心后，蔗糖溶液的密度以折射法测定折射率，按如下公式计算：[JZ]ρ=27329η20-26425蔗糖溶液的折射率如表13-2。 除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品，]经超速离心后将病毒收集于两层界面处；也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品，]经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不]如多层连续梯度法。
3.平衡密度梯度离心法
平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮力，亦称有效密度。[JZ]浮密度(有效密度)=m-m(ρ0/ρ)m为物质质量，ρ为物质密度，ρ0为介质密度。常用的介质有氯化铯(CsCl)、氯化铷(Rb]Cl)、硫酸铯(Cs2SO4)、溴化钾(KBr)、酒石酸钾(K2C4H4O6)等无机或有机盐。]病毒离心时，病毒粒子ρ比介质密度ρ0大，即ρ>ρ0病毒沉淀，ρ<ρ0时则上浮。]制备梯度的方法有两种：一种是在饱和的CsCI溶液上面层加病毒样品(容量比1∶4)；]另]一种是将病毒样品与CsCl浓溶液均匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在]离心管中形成CsCl的浓度梯度，并由于离心力的作用，样品中的病毒粒子分布于相应密度的]区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数越高，离心时]间越长，越能接近平衡状态。 平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密度梯度离心法提纯的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏，可加入02%～05%牛血清白蛋白，或用05%～30%甲]醛先将病毒粒子固定，然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在110～140范围内，见表13-3。所以制备密度范围为10～17的悬浮介质，便可满]足大多数病毒密度梯度离心的需要。用CsCl溶液进行平衡密度梯度离心时，以测定25℃时CsCl溶液的折射率(ｎ25]D的方法)，按照下列公式求得各梯度分层液的密度：密度范围为ρ＝100～138g/cm3时，ρ25=102402ｎ25D-126423〓](式1)密度范围为ρ=137～19g/cm3时，ρ25=108601ｎ25D-134974〓(]式2)ｎ25D指各梯度分层液在25℃时的折射率，ρ25指各梯度分层液在25℃时的]密度。例①〓以马传贫病毒在CsCl平衡密度梯度离心后提纯于第12分段部位中，此部分CsCl溶]液折射率为13510，求其密度： 将所得折射率代入式1中，则[JZ] ρ25=102402×13510-126423=11923 即马传贫病毒浮密度约为119。 例②〓急性传贫马血清中游离铁蛋白在CsCl平衡密度梯度离心后提纯于第18分段部位]，此部分CsCl溶液折射率为13811，求其密度： 将所得折射率代入式2中，则[JZ] ρ25=106801×13811-134974=15014 即铁蛋白浮密度约为150。 各种无机盐溶液的密度与折射率的关系，一般以下列公式表示：[JZ] ρ=a•n-b 如果知道各种盐类溶液的系数a和b，即可按测定折射率的方法简单地求得其密度。由折射率计算密度时，常用溶质的质数a和b值及其密度的适用范围如表13-5。
4.两种超离方法的比较
速度区带离心法和平衡密度梯度离心法各有特点，现将这两种超离方法加以比较，具体见表]13-6[JZ][HT5”H]表13-6〓速度梯度离心法与平衡密度梯度离心法的特点[HT6SS][]BG(!][BHDFG2，WK11，WK20ZQ，WK20ZQW][]速度区带离心法[]平衡密度梯度离心法][BHDG4]原理[]沉降与颗粒质量成正比，以物质沉降速度的不同进行分离[]沉降与颗粒的密度成]正比，以物质的浮密度不同进行分离[BHDG6]介质[]密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖浓度10%67%，密度1～13286预制梯度，]不连]续[]密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl浓度0～1355，密度为1～19025，自成连续梯]度[BHG4]离心力场[]强，离心速度高，使被分离物质易沉降[]稍强，速度相对低，使CsCl形成梯]度，建立沉降扩散平衡[BHG4]离心过程[]样品向离心管底沉降[]不论样品起始时在什么位置，离心中样品停留于介质]的等密度部位[BHG2]离心时间[]较短，一般为几小时到几十小时[]较长，十几小时到数天[BG)F]
5.密度梯度离心法的操作程序
(1)密度梯度的制备：制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作)和连续的(即机械操作)密度梯度两种。 不连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在20℃或在25℃)配制一系列浓度差为5%的梯度溶液，例如蔗糖可配制成5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、]40%(W/V)等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底，然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面被冲动破坏，则应重新制备。也可]以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。 连续的密度梯度的制备 为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。 [HT5”SS][JZ]图13-6〓简易的密度梯度溶液制备装置[JZ]A、B为盛蔗糖溶液的玻璃管。[JZ]1活塞双通；2搅拌棒；3活塞；4连接处；5聚乙烯小管[HT5SS]梯度混合装置如图13-6，由A和B管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞]关闭的状态下，向A管中加入低浓度蔗糖溶液，向B管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。当梯度液体自B管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃1～2小时，以平衡之。 现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按下式计算：[JZ]C=CA-(CA-CB)(1-V)-b/aA管和B管的横断面积各为a、b，其中所含蔗糖浓度分别为CA、CB，两液开始混合以]后流出Vml时流出液的浓度为C。A和B管的横断面积一般情况下相等，故a=b，这时获得的梯度为直线梯度。如果a≠b时，离心管中浓度梯度产生凸形和凹形梯度曲线。这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5%，40%→10%，或60%→10%等。
(2)加入样品：用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品(约梯度介质体积的1/10容量)，从液面上方1mm处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。
(3)高速或超速离心：将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状(如为透明的聚碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照)。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。
(4)梯度的分段收集(取样)：在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。
①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密]的介质，如60%～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。
②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。
③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经多次试证实，此法简]便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上50～100ml玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。[HT5”SS][JZ]图13-7〓从分部密度梯度中的分部收集[HT5”SS][GK4]从分部密度梯度中的分部收集A、B部分由有机玻璃制成，并利用螺帽C]紧密地装在一起，利用O形垫圈封起来。通过注入浓蔗糖溶液使管内成分缓缓向上挤入锥形]收集中而流出[HK] [HT5SS] ④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状)接在注射器上，从梯度最上层开始向]下逐层小心吸取液体。
6.梯度各层液体的密度测定
(1)称重量法：用10ul微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。
(2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃)，然后按照前述的公式ρ25=a•ｎ25D-b 换算成密度(g/ml)。
(3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品，找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。
7.各梯度分层液中病毒分布的鉴定
(1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液，用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm的OD值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质病毒含量图，有些病毒260nm]OD值较高。
(2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价；或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。
(3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
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