病毒基因探针的制备
选择病毒基因序列作为探针时,首先要考虑所选定的探针是否具有高度特异性,换句话说, 作为探针的核酸片段必须含有病毒独特的核酸序列;其次应考虑探针来源是否方便,探针通 常来源于重组质粒中已克隆的病毒DNA片段,这样易于大量制备。一般来说,探针的大小在1～ 3Kb左右,如小于05Kb,可能难以大量制备,而且标记率不高;反之,片段过大(大于3Kb),则容 易出现非特异杂交。 (一) 病毒基因探针的种类 根椐来源及 性质，病毒基因探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和化学合成的寡聚核苷酸探 针等几类。试验者可根据需要和实验条件来选择使用这些探针。 1、基因组DNA探 针 对于双链DNA病毒，可用限制性内切酶切割其基因组DNA，克隆其中一个片段作为 探针材料。这一片段应该最具有该病毒的特点，代表该病毒最特异的基因序列。应用这种特 异探针所取得的杂交结果是最真实可靠的。对于单链DNA病毒，其基因组DNA不能被限制性内切酶切割，所以难以克隆特异片段。制备这类病毒的探针时，一般首先使用DNA聚合酶，制备其双链DNA，或者提取感染细胞中的复制型双链DNA，用适当内切酶切割后，克隆特异片段制备探针。 2、cDNA探针 制备单链或双链RNA病毒的探针时，一般先对病毒RNA进行反转录,合成该病毒的cDNA ，然后克隆特异cDNA片段作为探针材料。 3、RNA探针 应用RNA探针进行分子杂交是较为理想的。因为：①RNA／RNA 或RNA／DNA杂交体比 DNA／DNA杂交体更稳定，杂交反应可在更严格的条件下进行，因而杂交的特异性更高，结果更可靠；②RNA探针为单链，不存在互补双链的竞争结合，其与待测 核酸的杂交效率更高；③杂交后，可用RNase将未杂交的探针RNA消化掉，从而使本底降低。 RNA探针大多是通过基因组DNA或cDNA克隆经体外转录而获得的。 4、寡聚核苷酸探针 根椐病毒的特异序列,于DNA合成仪上化学合成一段单 链寡聚核苷酸,即可作为探针使用。其优点是容易制备,可根椐需要随意合成任何序列 ,在合成时就可以加入带有标记物的某一种dNTP,因此片段合成后勿需另外标记,纯化后即可 直接进行杂交。这类探针较短,长度一般不超过50nt,所以它所带的标记物相对较少,其灵敏 度也较低。 (二) 病毒基因探针的标记因标记物的不同,基 因探针的标记方法可分为放射性标记法和非放射性标记法。无论是DNA探针还是RNA探针,均可用这两种方法标记。根椐标记的部位,放射性标记可分为核酸片段内标记和末端标记。分 述如下: 1、DNA探针放射性标记法用于诊断的杂交实验，通常使用片段 内标记法制备的探针。末端标记法制备的探针,由于是由均一片段组成的,所以通常用作S1 核酸酶作图和DNA测序。在此主要介绍片段内标记法,它包括:(1)缺口翻译:其原理是用微量的DNase I在双链DNA上随机形成单链切口,然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中去。大肠杆菌DNA聚合酶I( E.coli DNA polymerase I)具有两种活性:a.在缺口处从DNA5向3末端水解单链DN A;b.以一条DNA链为模板,从DNA5向3末端合成新的单链DNA片段。如果在DNA聚合酶处理 探针DNA片段的同时,加入α32P标记的dATP或dCTP和其它3种非标记碱基,32P 标记的碱基则可以掺入到新合成的DNA链中去,产生32P标记的放射性DNA片段。具体操 作方法如下:①用适当的内切酶从重组质粒中切下探针DNA片段,经普通琼脂糖电泳分离后 回收探针该片段;②取05～1μg探针DNA片段,加入25μl 10倍缺口翻译缓冲液(05 m o l/L Tris•HCl, 01mol/L MgSO4,1 mmol/L DTT,500μg／ml牛血清白蛋白组份V,pH75 ), 未标记dCTP、dGTP、dTTP各20nmol/L、50～100μCi α32PdATP,加水至25μl; ③用缺口翻译缓冲液加50％甘油,将胰DNase I稀释至10ng／ml,置－20℃冰箱备用;④ 加入25μl稀释的DNase I,混合,室温作用1分钟,使DNase I在DNA双链上水解出单链“缺口 ”;⑤加入25单位大肠杆菌DNA聚合酶I,混合;⑥置1 6℃水浴1小时;⑦加入1μl 05 mol/L EDTA终止反应;⑧标记探针直接可用于杂交检测。也可将标记探针通过Sephadex G25或50层析柱,分离纯化标记探针,去除游离的α32PdATP。缺口翻译标记的探针为单链DNA片段。应特别注意这种探针是不同分子量单链DNA的混合物。标记反应中,DNase I的浓度一定要适当，过高的浓度产生过多的缺口，从而使探针长度 过短，影响杂交效率；过低的浓度可因缺口产生过少而使标记效率下降。缺口翻译制备的探针可用于原位杂交、Southern和Northern 打点杂交，但不能用于S1核酸酶作图。它的 优点是可以对同一张硝酸纤维膜进行不同探针的多次杂交。我们曾用同一张膜进行过6次不 同探针的杂交。每次杂交后只需将膜放入2倍SSC煮沸两次，每次十分钟，即可基本消除杂交 的探针，而不影响吸附在膜上的病毒DNA片段。这一优点特别适用于分子量相似的病毒DNA片 段的检测。(2)随机引物法(random priming):在待标记的探针DNA变性后加入随机引物( 常用化学合成的六核苷酸寡聚物)，在随机引物的引导下和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段的催 化下合成探针链。在合成过程中，加入放射性或非放射性标记的dNTP进行标记。标记方法如 下：①取一微量离心管，依次加入下列试剂： 5倍标记缓冲液 10μl dATP,dTTP,dGTP混合物 各20μmol／L 变性的待标记DNA模板 25ng 1mg/ml牛血清白蛋白 2μl α32PdCTP 50μCi DNA聚合酶Ⅰ 大 片段 5单位 加灭菌去离子水至50μl ②混匀，离心,室温反应至少1小时 。为了提高标记效率，可室温反应过夜;③100℃煮沸2分钟终止反应，置冰浴，加入ED TA至20mmol/L终浓度;④标记的探针无需进一步纯化或乙醇沉淀，可直接用于杂交反应 。 5倍标记缓冲液： 250mmol/L Tris•HCl,pH8 025mmol/L MgCl210mmol/L 二巯基苏糖醇(DTT)1mol/L HEPES，pH6626A260单位／ml 随机六核苷酸引物 放射性同位素标记探针的缺点在于制备和 使用时操作者必需接触到一定剂量的放射性照射，如果防护不当，可能对健康造成一些影响 。另外,32P的半衰期为1429天，标记好的探针在冰箱中存放两个月后便不能使用。 近年来，人们开发出非放射性探针，以弥补上述缺点。根据我们的经验,非放射性DNA探针的 灵敏度与32P标记探针接近(但直接显色法比32P探针的灵敏度低10～100倍)， 制备的探针可以反复使用，在-20℃冰箱中可以保存一年以上。该方法还可以用单链DNA为模板制备探针，因此适于制备单链和部分单链DNA病毒的探针。 2.DNA探针非放射性标记法 该方法的原理与上述的随机引物法一样。只是将同位素标记的dNTP 换成非同位素如地高辛标记的dUTP。用标记的探针与被检DNA或RNA杂交。加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体与杂交的探针结合，最后加入显色剂5溴4氯3吲哚磷酸盐(BCIP )和硝基兰四氮唑(NBT)直接在硝酸纤维素膜上显色。目前已有市售的药盒可供使用，操作 上并不复杂。以德国柏林格公司地高辛DNA标记试剂盒为例，其标记方法如下：①取10 ng～3μg待标记DNA，用酚、氯仿抽提，并用乙醇沉淀，溶于10μl 去离子水中；②95 ℃水浴5分钟，使模板DNA变性,立即置于冰浴5分钟；③加入2μl六核苷酸引物，2μl dNTP标记混合液(含地高辛dUTP)，1μl Klenow片段，并加水至20μl；④37℃水浴 过夜(15小时)；⑤加入2μl 02mol/L EDTA(pH80)终止反应；⑥加入25μl 4 mol/L LiCl和75μl无水乙醇，充分混合；⑦置-70℃30分钟或-20℃2小时沉淀探针DN A；⑧离心沉淀，洗涤,抽干；⑨将探针DNA溶于50μl TE缓冲液,即可用于杂交。 3、RNA探针标记法RNA探针的制备与标记一般通过体外转录进行。即将 探针DNA片段克隆到噬菌体启动子驱动的转录表达载体中，通过启动子特异的RNA聚合酶的催 化作用，在试管中以探针DNA的一条链为模板，转录RNA链，在转录过程中，如加入放射性或 非放射性标记的rNTP(通常用标记的rCTP,rGTP或rUTP)，合成的RNA即可作为探针。转录载体中所使用的启动子是噬菌体的特异启动子，如SP6，T7，T3等，每一种启动子被各自 的RNA聚合酶识别。所以应用不同的启动子就可构建不同类型的转录载体。目前这些载体 均已商品化，可根据不同的实验进行挑选，但转录RNA的操作过程基本一样，只是注意根据 启动子类型来选择RNA聚合酶。如果在一个载体中有二种不同的启动子,这就构成了成对启动 子转录体系(如T7／SP6,SP6／T3,T7／T3等)，外源DNA片段可插入这二种启动 子之间，其优点在于可根据实验需求选择转录正链还是负链。在转录时如果右端的启动子转 录mRNA，那么左端的启动子则转录与mRNA互补的反义RNA。转录质粒构建、模板制备及标准 转录过程如下：①将探针DNA片段插入转录载体的启动子，如SP6或T7下游，构建 转录质粒;②用适当的限制性内切酶在插入片段下游将转录质粒线性化;③酚／ 仿抽提，乙醇沉淀，重溶于无菌水中，浓度在02～10μg／μl之间;④室温下，在一无菌微量离心管中依次加入下列试剂： 5倍转录缓冲液 40μl 100mmol／L DTT 20μl RNasin(RNase抑制剂) 20单位 rATP,rGTP和rUTP 混 合物(各25mmol/L) 40μl 100μmol/L rCTP 24μl 线性化模板DNA 10 μl ａ32PrCTP(10mCi/ml) 50μl(50μCi) SP6或T7RNA聚合酶( 15～20u/μl) 10μl 加无菌水至总体积20μl ⑤混合后37～40℃温育6 0分 钟；⑥加无RNase的DNase，1u/μg DNA；⑦37℃温育15分钟，消化模板DNA；⑧酚／ 仿抽提，乙醇沉淀，RNA探针重悬于灭菌TE，置－70℃保存备用。 5倍转录缓 冲液： 200mmol/L Tris•HCl,pH7530mmol/L MgCl2 10mmol/L 亚精胺(spermidine)50mmol/L NaCl 由于转录的RNA探针是单 链，极易降解。因此在转录、纯化及随后的杂交操作过程中，要特别注意防止RNase的污染( 详见病毒RNA提取)。
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