PCR的全称是聚合酶链式反应(polymeras e chain reaction),它是由Kary Mullis于1987年发明的。1976年人们发现 了一种特殊的DNA聚合酶,它可以耐受94℃高温而不失活。1985年Saiki等人发现用聚合酶Kle now大片段催化25次DNA聚合反应(由于此酶不耐高温,所以每次反应需加入新的Klenow片段) 可以将原有的DNA量特异地增大数百万倍。将上述两个实验合并在一起,用抗高温的DNA聚合 酶( Taq 或 Vent )代替Klenow片段就形成了 目前广泛应用的具有高度敏感性的DNA PCR扩增技术。根据被扩增DNA片段的序列,人工合成 两端各约15～30碱基的单链DNA引物。取极微量的模板DNA,加入 Taq 或 Vent DNA聚合酶,A、C、G、T四种脱氧单核苷酸以及两端的DNA引 物,置于PCR扩增仪上即可以进行DNA扩增。一次PCR循环,包括变性→退火→延伸三个过程,通 常使用三个可调温度及时间:①DNA变性温度(一般为94℃)及时间,在此温度下模板DNA的双 链分开;②退火温度及时间,这个温度可以根据DNA引物的长度和G+C含量计算出来,一般在4 2℃～62℃之间。退火处理后,DNA引物互补杂交到变性的DNA模板上;③聚合酶延伸反应温 度多为72℃,反应时间随被扩增片段的长度而定,一般每合成1 000个碱基需要30~60秒和1单 位 Taq DNA聚合酶。如合成5kb片段,延伸反应时间应为5分钟,并使 用5单位 Taq DNA聚合酶(反应体积 为100μl)。有时PCR使用双温循环,即92～94℃变性→68℃退火和延伸。理论上,每循环一次 ,模板DNA量扩大一倍,所以模板DNA的量是按2n指数幂进行扩增的,n代表PCR次数。如模板D NA数为1,PCR循环25次后,模板数将增至225,即33 554 432, 但在实际操作中,扩增效 率往往低于理论值。这是因为DNA引物经多次循环后被消耗,在下一次循环时,没有足够浓度 的引物与模板退火杂交。此外,多次高温处理后, Taq DNA聚合酶活 性也会下降。即使这样,PCR也可在数小时之内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍,使其 在凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。这是PCR技术正逐步用于临床病毒检测的最重要原因。 另一方面,很高的合成效率使得PCR容易出现非特异性扩增,所以要获得预想的结果,必须选好 欲扩增片段在基因组上的位置,设计特异的引物序列,优化PCR反应的各种条件和选定适当的 循环参数。 (一) 诊断PCR技术的设计战略 1、扩增片段的确定 为了获得特异的扩增,仅仅知道被检病毒的基因序列是不够的,必须选择病毒基因组上具有独特结构的基因区域进行PCR扩增,这一 区域在序列组成或长度上,无论与较近亲缘关系还是较远亲缘关系的其他病毒应有明显的区别。 2、引物设计 引物是影响PCR扩增效率和特异性的关键因素。作为诊断PCR,选择引物应遵循一些基本原则:①引物长度以15～30nt为宜;②正义、反义二条引物链间的距离适中,一般使扩增出的片段在300～1 000bp之间,如果用反转录-PCR检测RNA病毒, 引物间距离控制在500bp左右最佳。片段过短则影响电泳结果判定,过长则不易扩增;③引物 碱基组成应随机分布,G+C含量在45%～55%左右为宜;④引物自身不形成二级结构,引物间不应 有互补序列(4个碱基以上);⑤引物序列必须是被检病毒特异的;⑥原则上引物3末端碱基与 模板DNA一定要配对,此外3末端碱基最好选T、C或G, 而不选A。 3、PCR缓冲 液 PCR反应标准缓冲液应含:50 mmol/L KCl, 10mmol/L Tris•HCl(pH83),15mm ol/L MgCl2和100μg/ml明胶或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg2+浓度变化明显影响反应的特异性和扩增效率。Mg2+过多则导致非特异扩增产物增加;Mg2+不 足则扩增效率降低。为了取得最佳扩增效果,可先行预实验,以确定最佳Mg2+浓度。 4、引物量 PCR反应中所用引物浓度通常在01～05 μmol/L之间。浓度 过 高将出现非特异片段的扩增,过低则不能扩增出足够的特异带,最佳用量可以通过系列浓度实 验来确定。 5、dNTP dNTP(dATP,dTTP,dCTP和dGTP)溶液的pH值应调至70 。在标准PCR反应中,每一种dNTP的使用浓度为50～200 μmol/L(足够产生7～25μg DNA),更 高浓度dNTP将导致错误掺入,从而影响扩增序列的真实性。 6、 Ta q DNA聚合酶 PCR反应中,该酶的用量,通常是25单位。加酶 量过多将导致非特异性片段的扩增。 7 、变性剂 反应中加入适量变性剂(如二甲亚砜、尿素、甲酰胺等)可减少模板的二级 结构,提高反应的特异性。我们在用PCR扩增猪瘟病毒cDNA片段的反应中,加入5%甲酰胺,不但 提高了反应的特异性,而且目的cDNA片段的产量大大提高。 8、循环参数 用3种不同温度处理样品,使之变性,退火和延伸,就可进行PCR循环。PCR操作可于三个不同温度的水浴锅内手动完成,或者于PCR循环仪上自动完成。变性是循环的第一步,变性不完全,扩 增明显受到影响,变性温度太高或时间太长, Taq DNA酶的寿命受到影 响,使得循环次数明显减少。绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间,时间通常控制在40秒左 右;退火是循环的第二步,退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性,是PCR 能否成功的关键因素。选择适当的退火温度,取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰 度。较高的退火温度可 提高引物与模板配对的特异性,从而提高反应的特异性。就含量和纯度较高的模板而论,对于 G+C含量在50%左右的约20nt长的引物,55℃是常用的退火温度。如果引物较短(12～15nt)退 火温度可降至40～45℃。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT PCR),在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明 显提高PCR的成功率。我们在猪瘟病毒和犬瘟热病毒基因组RT PCR扩增中,第一次循 环的退火温度用37℃,从第二次循环开始改为50℃退火,成功地扩增出了常规退火温度下没 能扩增出的特异cDNA片段。无论什么样的退火温度,时间通常控制在50秒左右。循环的最后 一步是延伸,由于 Taq DNA聚合酶只有在高温下才能发挥最大活性, 所以延伸在70～75℃温度下 (通常在72℃)进行,但延伸反应的时间随欲扩增片段长度的增加而适当延长。一般来说,每扩 增1kb 的片段,用1分钟时间是足够的。温度及时间确定以后,PCR循环次数主要取决于模板量。但循 环次数通常选定在25～30次,经过这些次数循环后,PCR产物的累积即可达到电泳后肉眼可见程度。除非模板浓度极低,如只含一个拷贝,循环可增加至40次。目前双温PCR正逐渐 被采用,其特点是退火与延伸在一个温度下进行,这一温度通常在68℃左右。双温PCR大大简 化了操作程序，缩短了操作时间，同时明显提高了反应的特异性。 ( 二) PCR反应的一般程序 ①按以下程序,将各成份依次加入05ml PCR反应管： 10倍标准PCR缓冲液 10μl 4种dNTP混合物,每种浓度为125 mmol/ L 16μl 正向引物 100pmol或05μg左右 反向引物 100pmol或05μg左 右 被检DNA样品取决于靶序列含量,可达2μg 加灭菌去离子水 至终体积100μl 石蜡油 20μl ②92～94℃变性5分钟;③置选定的退火温度，加入25单位 Taq DNA聚合酶(置退火温度以下,引物与模板可能出现许多非特异杂交,此时加入酶就可能有非 特异链的合成,最终导致非特异带扩增);④置PCR仪或水浴锅,用选定的变性、退火和延伸温度及时间,进行25～40次自动或手动循环反应,最后一个延伸温度保温5～10分钟;⑤ 取5～10μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳、观察、拍照和记录。 10倍标准PCR缓冲液 : 500mmol/L KCl,100mmol/L Tris•HCl(pH83,室温),15mmol/L MgCl2, 01％明胶或乙酰化BSA 由于不同的反应条件,PCR合成 的DNA片段中碱基序列可能会有03%～05％的误差,因此,如果需要克隆PCR片段,制备点突变或缺失突变株时,最好使用 Vent DNA聚合酶。该酶具有校对错误 碱基的功能(proof reading activity),它可以从5末端向3末端合成DNA,也可以从3末 端向5末端校对并水解掉错配的碱基,因此合成误差比 Taq DNA聚 合酶小得多。不过,在诊断上,这样的误差一般不会影响最终结果。 (三) PCR用于DNA病毒的检测 无论单链或双链病毒DNA，均可用PCR进行检测。检测样品可以是纯化DNA,也可以是细胞 、组织及任何可能含有病毒的样品。一般无需提取DNA,可直接取少量样品(少于10μl),煮沸 变性10分钟后进行PCR测定。如前所述,PCR检测需要两个特异的DNA引物,引物之间的距离(决 定扩增DNA片段的长度)控制在03～1kb之间最佳。如果扩增片段达2～5kb,PCR反应产物在 随后的电泳中,可能出现多条DNA带,这时往往需要用Southern 转移杂交来鉴定哪一条是病毒 特异的带。为了尽量减少PCR的非特异反应,可进行如下调整。1、增加DNA引物的长度。一般引物长15～20碱基,但可以增加到25～30碱基;2、引物加长后,提高退火温度,增加反应的特异性;3、选择其它DNA序列重新合成特异的DNA引物;4、如果病毒的序列来源于cDNA ,则应考虑到某些病毒DNA上含有内含子,可能使被扩增的片段远远大于原设计,甚至无法 得到这样大的片段。 (四) PCR用于RNA病毒的检测 由于 Taq 或 Vent DNA聚合酶不能以RNA为模板合成 cDNA,所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR。首先必需提取病毒RNA,加入反转录酶合成cDNA, 然后才能进行PCR扩增。因此必需进行两步反应(反转录酶不耐热)。这就是所谓的反转录-PC R(RT PCR)。病毒RNA可以从各种适合的组织 器官、排泄物、分泌物或细胞培养物中提取,这取决于被检病毒的种类。RTPCR同样具有很高的敏感性。作者从100μl猪瘟兔化弱毒的犊牛睾丸细胞培养物中提取了病毒RNA,用 下述RT PCR方法,从中扩增出了特异cDNA片段。 第一步： 反转录合成第一链cDNA:①取一反应管，分别加入：病毒RNA（或感染细胞总RNA） 适量 10倍标准PCR缓冲液 5μl 25mmol/L dNTP 5μl正向引物 05μg反向引物 05μg RNasin 40单位 反转录酶(AMV) 10单位 去离子水 至终体积50μl②42℃水浴1小时。 第二步： PCR扩增:③将上述反应物煮沸变性5分钟，立即冰浴；④加Taq DNA聚合酶2单位；⑤置PCR仪,用选定的变性、退火和延伸温度及时间，进行30～40次循环反应；⑥取5～10μl反应产物,进行电泳、观察、拍照和记录。反转录反应中，用PCR缓冲液代替反转录缓冲液，同时加入正、反向引物,既简化操作步骤 ，又不影响反应效率。应用该方法，我们还成功地从感染细胞总RNA中扩增出了牛病毒 性腹泻病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒的特异cDNA片段。1990年人们发现了一种极其耐热的反转 录酶,可以将两步反应合并在一起,前半部为反转录酶合成cDNA,后半部为PCR,只需适当调整P CR的工作时间及温度,则可直接得到PCR扩增的cDNA片段。目前已有市售的RT PCR试 剂盒供使用。 (五) PCR用于分子流行病学研究病毒在自然 界中产生自发突变株是长期困扰病毒学工作者的棘手问题。例如流感病毒、牛病毒性腹泻病 毒、脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒等都会因地理或生态环境，动物体的内环境(如易感性、 免疫压力等)，气侯和时间因素等的变化而自发产生基因突变的变异株,使人或动物的免疫系 统无法正确识别,导致原有的疫苗接种失败,造成病毒大量传播。就其本质来说,病毒发生 突变是指病毒基因的缺失、插入、交换和基因点突变等。PCR技术的出现,使人们 有可能大规模、且十分精细地研究病毒突变的规律及突变位点,迅速地鉴定突变株,从分子水 平上阐述病毒病的流行规律,这是目前分子流行病学的主要研究内容之一。在可能发生缺 失 的病毒基因两侧合成DNA引物,进行PCR或RT PCR,通过电泳即可清楚地看到被扩增的片段小于对照株;如果外源基因插入某个位点,用这个位点两侧的DNA引物进行PCR扩增,就可以发现扩增的片段大于对照株。美国科学家用多种因素(化学、物理)处理脊髓灰质炎病毒 ,然后制备cDNA。对混合的cDNA进行PCR,发现了多种不同的突变株。他们还使用PCR研究不同 口蹄疫毒株之间的重组。他们首先在两个毒株的核酸序列上寻找两个非同源序列,合成DNA引 物。引物Ⅰ只能与A株杂交,引物Ⅱ只能与B株杂交。因此,用这两个引物不能对A株或B株的cD NA进行扩增。将A、B两株在不同条件下混合感染单层培养细胞,提取病毒RNA制备cDNA,最后用引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR。如果电泳中发现特异的DNA带,同时此DNA带能与32P标记的两 个DNA引物杂交,则说明A、B两株的基因组RNA在两个DNA 引物中间的序列发生了基因重组。 用此方法可以迅速准确地测定试验室内病毒发生基因重组的条件。令人惊奇的是经PCR扩增 后,电泳中往往出现多条分子量不同的带,核酸序列分析说明A、B两株间有多个不同的重组位点。有人采用RT PCR技术,对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的基因突变进行了研究, 发现许多致细胞病变BVDV毒株的P80基因区有外源核酸序列的插入(大小约数百个碱基 ),而非致细胞病变毒株则没有这种插入。当然,PCR结果还难以说明病毒遗传变异株的稳 定性、毒性、滴度、致病性等多项病毒学指标,然而这些研究结果说明了病毒间基因重组的复杂性和重组的条件,使人们有可能着手研究病毒重组突变机理。
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