兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus)
兔出血症(RHD)是兔的一种急性高度接触性传染病。以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血及出血性变化为特征。本病于1984年初，首先在我国江苏等地爆发，随即蔓 延到全国多数地区。此后，世界上许多国家和地区也报道了本病。在我国确证兔出血症以后，欧洲进行了兔出血症病毒(RHDV)的病毒学和血清学回顾性调查，发现1982年保存的病料中即含有兔出血症病毒(RHDV)相关的病毒，他们还从保存了12～13年的血清样本中检出了相 关的病毒抗体，这说明该病毒在欧洲的兔群中已经存在了许多年 ，但当时欧洲的兔群中并没有爆发RHD。鉴于中国在八十年代初期大量从西德引进长毛兔，1984年开始爆发RHD，有人推测，很有可能是随 着生态环境的变化，使原来存在于欧洲但基本上无致病性的家兔或野兔杯状病毒突 变成为RHDV而首先在中国出现，并引起疫病爆发。 图17-2 兔出血症病毒的形态结构
理化学特性 RHDV在氯化铯中的浮密度为129～134g/cm ３，沉降系数为85～162S。对乙醚、氯仿和pH3有抵抗力，能够耐受50℃1小时的处理。 RHDV含有一条单股正链RNA，由7437个核苷酸组成，分子量为24×10６～26×10 6，5’末端没有帽状结构，而代之以与感染性相关的VPg蛋白，3’末端具有一个短的P oly(A)尾。RNA基因组含有两个开放阅读框架(ORF)，5’末端的ORF编码一个23 44氨基酸的多聚蛋白前体。该前体被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白和非结构蛋白，其中衣壳蛋白的分子量为65kDa，该ORF相当于其它杯状病 毒的ORF1和ORF2(见图17-1)。3’末端含有一个开放阅读框架(ORF),可能编码一 个小的蛋白。除基因组RNA外，病毒颗粒中还含有22kb的亚基因组mRNA,它转录自基因组衣壳蛋白基因3’末端，编码衣壳蛋白。最近(1995)，比较RHDV基因组5’末端的460 个核苷酸发现，分离自埃及、法国、德国、西班牙的多株RHDV，其差异仅有13%～34%， 说明RHDV自出现以来，尚未发生大的变异。
3.血凝性兔出血症病毒与其它杯状病毒相比，最显著的特点是具有血凝性，RHDV能够凝集人类的各型红细胞，肝病料中的病毒血凝效价可达10×220，平均为10×2１４；RHDV也凝集绵羊、鸡、鹅的红细胞，但凝集能力较弱；不凝集其它动物的红细 胞。红细胞凝集试验(HA)在pH45～78的范围内稳定，最适pH为60～72；如pH低于4 4，则会导致溶血；pH高于8.5，吸附在红细胞上的病毒将被释放。该吸附释放现象可用于RHDV的提纯。血凝素对氯仿、乙醚、受体破坏酶(RDE)、过碘酸钾不敏感，甲醛因灭活病毒而使HA效价下降，胰酶、硼氢化钠、氯胺T等则可使血凝素的活性完全丧失。
4.抗原性HI试验、琼脂扩散试验、ELISA和中和试验证实，世界范围内的RHDV均为同一 血清型。欧洲野兔综合症病毒(EBHS)与RHDV抗原性相关，但血清型不同，前者的抗血清不能 抑制RHDV的血凝作用，用RHDV特异性单克隆抗体或高免血清作ELISA、免疫电镜、免疫印迹 可将二者区分开来，动物交叉保护试验和传递试验也显示二者之间有较大的差异。
5.增殖兔出血症病毒不能在鸡胚上增殖，也难于在各种原代或传代细胞中稳定增殖，至今尚未真正找到一种能够使其长期传代的细胞。吉传义等报道，该病毒至少可在兔 肾传代细胞上增殖10代，传至第3代以后，细胞开始出现规律性的病变，于接种病毒后24～ ７２小时内，大量细胞变圆、凝聚和脱落，但从传代后的病毒接种培养物中，只能检测到很低的血凝价，甚至没有血凝性。萧庆麟等报道，RHDV接种Vero细胞和MA104细胞均可产生细 胞病变，在Vero细胞上的细胞病变表现为细胞萎缩、部分变圆和脱落，但传至第三代以后，病变消失。罗经等报道，RHDV同步接种乳兔肾(RK)细胞或乳兔肺(RL)细胞48～72小时后，产生细胞病变，并能观察到特异性荧光。这些结果都有待于进一步证实。
6.病原性引进的纯种兔和杂交兔比我国本地兔易感，毛用兔比肉用兔易感。在自然条件下 ，RHDV只感染年龄较大的家兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不发病，人工感染3～5日 龄初生兔，即使大剂量攻毒亦不发病。未发现野兔自然感染造成的大批死亡，人工感染野兔不发病 ，但可产生低滴度的特异性血凝抑制抗体(1∶5～1∶40)。其它动物均无易感性。病死兔 的内 脏、肌肉、皮毛、排泄物、分泄物均可带毒，可通过直接接触而传播，也可以通过被污染的饲料、饮水、笼具以及剪毛、医疗器械和人员来往而间接传播。消化道、呼吸道、生殖道及 损伤的皮肤均可成为病毒侵入途径。人工感染的潜伏期为16～７２小时，自然病例的潜伏期为2～３天。最急性病例多见于新疫 区及流行初期，一般无任何前驱症状，死前数小时突然倒地，呈昏迷状态，临终时表现出短暂的兴奋，而后挣扎、抽搐，尖叫几声后猝死，典型病例可见鼻孔中流出鲜血。急性病例体 温升高至405～４１℃或更高，精神萎顿，皮毛松乱，食欲废绝，呼吸迫促，濒死期全身 瘫痪，横卧不起，反射消失，一般在症状出现后6～8小时内死亡，孕兔会发生流产 。温和型病例仅出现轻度体温反应，精神不振，食欲减少和呼吸加快等，除非仔细观察很难发觉，病程4～5天，一般不死亡。这类病兔可带毒和排毒，是很危险的传染源。兔出血症的病变特点是各组织器官弥漫性的点状出血和实质器官的淤血、水肿和变性 。鼻腔、喉和气管粘膜弥漫性充血、出血，气管内充满大量血染泡沫；肺脏上有数量不等大小不一的出血斑、出血点，并有水肿；心脏扩张、淤血，心包积液；心包膜点状出血；肝脏 肿大，呈土黄色或淡黄色，水肿，质脆；脾脏淤血，肿大，肾脏淤血，呈暗紫色；十二指指肠粘膜、回肠粘膜、内分沁腺、性腺、输卵管和脑膜亦可见充血和出血。组织 学检查可见肝、肺、心、延髓等重要组织器官的微血管形成弥漫性血 管内凝血，间质水肿，实质细胞广泛变性和坏死。但澳大利亚的学者报道，当地出血症死亡兔可能看不到出血，他们认为出血不是本病的一个 突出特征。 用HA法和ELISA法检测人工感染家兔，发现病毒主要存在于肝脏，临死前才进入血液。死 亡兔各脏器中的病毒含量由高至低依次为肝脏、血液、脾脏和肺脏，而肾、胸腺、心肌、脑、肠和骨骼肌的病毒含量很低。用免疫荧光和免疫胶体金法证明，RHDV主要定位于感染细胞 的胞浆，感染后期，随着细胞坏死而进入细胞核内。[BT4]7.免疫人工攻毒致死的家兔，经肝、脾等脏器经研磨成匀浆后，可甲醛或其它仅化学剂将病毒灭活 ，即为灭活疫苗，灭活疫苗具有良好的免疫效果，一般在接种后6～8天产生HI抗体，16～18 天HI 抗体滴度可达211以上，以后缓慢下降。铝胶苗的免疫期可达8～１０个月，油佐剂 疫苗的免疫期可达1年以上。灭活疫苗诱生干扰素的能力也很强，在注射油佐剂灭活疫苗后1 8小时，诱生的干扰素达高峰，血清中的干扰素效价在1∶200以上，疫苗的早期抗病毒作用 主要是通过干扰素发挥的。干扰素诱 生剂PolyI:C诱生的高水平干扰素亦有很强的抗RHDV能力，曾有报道，注射polyI:C6小时， 诱生的干扰素达到高峰，12小时后下降。10小时时用强毒攻击，试验兔100%被保护。被动免疫也有良好的预防和治疗作用，肌肉注射高免血清02ml即可抵抗强毒攻击。发病后 体温升高时，立即用1ml高免血清治疗，大部分病兔可被治愈。[BT4]8.诊断兔出血症大多数为最急性型和急性型，发病后精神沉郁，呼吸困难，很快死亡。 剖检可见死兔营养良好，全身血液循环障碍，实质器官充血、出血，根据这些特点可作出初步诊断。确诊则需经实验室检查。
(1)血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验微量法和玻板法均可。多数人习惯使用人的“O”型 红细胞，但据杨汉春等报道，使用人的不同血型新鲜红细胞所得结果无明显差异。亦可将人的红细胞通过高锰酸钾固定后使用，此时HA或HI反应需在4℃进行，因为在22℃和37 ℃反应时，固定的红细胞易自凝。血凝试验(HA)用于检出病、死兔 体内的病毒。病、死兔的肝脏或脾脏，研磨后加生理盐水制成1∶5～1∶10的悬液，可以直接用于本试验，具体操作方法参见本书第十四章。在本病流行初期，这些病料中的病毒血凝 效价可达10×213～10×218。玻板法用于现场检疫，快速而简便，5分钟即可得到 结果。出口的兔肉匀浆，冻融后用PEG浓缩50～100倍，离心取上清即可能用于兔肉中是否带毒的检测。HA试验得到的结果应通过HI试验确证。HI试验的特异性及敏感性都 很高，可用于 流行病学调查和疫苗免疫效果检测，这种情况下多采用β法血凝抑制试验术式；也可用于可疑病毒的血清学鉴定，此时多采用α术式，当阳性血清能降低被检病料血凝效价2个滴度以 上时，即为阳性。
(2)间接血凝试验(IHA)杨汉春用纯化病毒，以戊二醛醛化绵羊红细胞为载体，建立了间接血凝试验，用以检测抗体效价。其敏感性比HI高32倍，比AGP高1024倍。间接血凝抗原制备的最适条件：抗原浓度为1 5μg/ml,在37℃致敏1小时，最适反应温度为37℃45min。
(3)琼脂扩散试验(AGP)矫正德等用病死兔肝脏乳剂制备的冻融抗原对感染病毒的兔血清进行本试验，检出了沉淀抗体；戴康等发现以甲醛灭活制备的抗原与抗血清反应时，粗 提抗原可出现2～3条沉淀带，高度提纯的抗原则只出现一条带。
(4)酶标抗体技术王启明等采用双抗体夹心法ELISA试验快速诊断本病，结果与血凝试验 具有良好的相关性，敏感性差别不大；潘荣生等应用双抗体夹心法检测冷冻兔肉产品中的RH DV，并与HAHI试验对比，发现二者的敏感性相近，检测骨髓样品时的符合率为977%，检 测肌肉样品时的符合率为809%。酶标抗体染色法快速诊断本病的效果也很好：取病 死兔的肝脏或脾脏，触片或制作冰冻切片，按常规法进行固定，与抗血清和酶标抗体反应，在显微镜下观察到特异性的感染细胞即可作出诊断。
(5)间接荧光抗体技术应用该技术快速诊断兔出血症，其结果与血凝抑制试验具有良好的相关性，病毒感染的组织细胞或细胞碎片，染色后呈现明显而清晰的黄绿色荧光。(6)反转录聚合酶链式反应(RTPCR)Guttré等以5’末端衣壳基因为对象设计了RTPCR 和套式RTPCR，结果说明本法比ELISA敏感10４倍，可以检出少至12个拷贝的病毒核酸。
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