鼻病毒和肠道病毒在病毒粒子的形态结构和化学组成上十分相似。但是两者在氯化铯密度梯度中的浮密度有着比较明显的差别，鼻病毒的浮密度为138～156,而肠道病毒只有133～144。这可能是由于不同的衣壳蛋白在结合铯离子以及对原先结合于病毒粒子上的阳离子进行交换的能力不同。 表16-3 口蹄疫病毒、鼻病毒和肠道病毒的某些理化学特性 病 毒 属 病 毒 氯化铯中的浮密度 耐酸性 直 径(nm) 壳 粒或亚单位数 RNA(%) 口蹄疫病毒属鼻病毒属肠道病毒属心病毒属 口蹄疫病毒鼻病毒14脊髓灰质炎病毒脑心肌炎病毒 143138~141134134 不耐pH<7不耐pH<7耐pH3~10耐pH3~10 23~25232724 60606060 3153029315 小RNA病毒没有必需脂质,故对乙醚、氯仿和胆盐等有机溶剂具有极大抵抗力。肠道病毒还有明显的耐酸和抵抗蛋白水解酶的特性,但鼻病毒和口蹄疫病毒对酸敏感。病毒的许多理化学和生物学特性都与病毒蛋白有关,因此有必要对病毒蛋白进行深入研究。病毒衣壳蛋白至少有4种功能:1.保护病毒RNA不被环境中的RNA酶水解;2.识别由宿主细胞编码的位于细胞膜上的病毒受体;3.决定宿主范围;4.感染的组织特异性。此外,衣壳蛋白还具有特异的抗原性,以及将病毒RNA包装进入衣壳和将病毒RNA释放到宿主胞浆中的能力。口蹄疫病毒VP1蛋白不仅是主要的抗原,并且含有病毒受体结合区。用人工合成多肽证明主要的抗原决定簇位点在141～160号氨基酸残基上,细胞膜受体结合位点在203～213号氨基酸残基上。但是有人认为145～147号氨基酸(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸,RGD)是细胞吸附位点。美国梅岛动物疾病研究中心的科学家们最近(1994)发现,RGD序列内发生改变的RNA转染BHK细胞后产生的非感染性病毒粒子不能吸附和感染BHK细胞。Rieder等人发现口蹄疫病毒VP1中132～159号氨基酸残基形成一个G-H环,并暴露于病毒衣壳蛋白的外侧。用C型和O型同源序列取代A型的G-H环序列,转化细胞产生新病毒,单克隆抗体鉴定为O/A和C/A。Brown等人在pH64条件下筛选变异株,发现口蹄疫病毒抗酸株(AR株)形成的蚀斑明显小于野生株,在BHK细胞中复制速度明显减慢,毒力下降100倍。电子显微镜观察病毒粒子比野生型小20%。等电聚焦电泳显示VP1与野生型明显不同。因此VP1可能与病毒的耐酸性有关。这一结果与我们较早在肠道病毒与口蹄疫病毒重组研究中的发现相类似。试验证明,VP1含有5个β片层结构,VP2、VP3含3个β片层结构,VP1、2、3均含2个α螺旋结构。与β片层结构相连的环形结构位于壳粒表面,所以环形结构在免疫学中占重要地位。VP1、2、3的C端位于壳粒外侧,N端位于内侧。这些末端可以自身或与其它蛋白末端结合(包括与VP4结合),使病毒壳粒结构更加稳定。VP4存在于衣壳内部。P2和P3区的蛋白主要参与蛋白质的加工及病毒RNA复制。小RNA病毒RNA5末端不含有一般宿主细胞mRNA的“帽”结构,但在5末端第一个碱基上以共价键与VPg上的酪氨酸残基结合。实验发现病毒RNA复制过程中正负链5末端都含有VPg,VPg可能在复制过程中起“引物蛋白”(primerprotein)作用。这种特殊的RNA复制方式与宿主mRNA转录不同,因此当宿主蛋白质和RNA合成受到抑制时,并不影响病毒RNA的合成。哺乳动物细胞蛋白质翻译过程中需要起始因子eIF-4F,该因子中最大的一个蛋白称为P220。在病毒感染早期,P220被水解成小肽,使宿主翻译因子失活。2A蛋白酶参与P1、P2之间的Gln-Gly水解反应,同时还发现鼻病毒和肠道病毒的2A基因编码蛋白参与P220的水解反应,而口蹄疫病毒则由引导蛋白L参与这一反应。由于宿主蛋白和RNA合成受到抑制,因此往往在感染后4小时,宿主DNA合成就受到抑制。有趣的是,小RNA病毒的2A和L蛋白只能水解P220,从而抑制带有5帽结构的mRNA转录,而不能水解病毒的3D蛋白,因此不影响病毒RNA的复制。
甲型肝炎病毒(HAV)在培养细胞中复制极慢(需5～7天),Minghelli-Schmitt(1993)等人用甲型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒的cDNA进行体外内切酶水解重组,将甲型肝炎病毒1～3214碱基片段与脊髓灰质炎病毒3302-5末端连接。用重组质粒转化COS 1细胞,合成新的重组病毒粒子。重组病毒只需3天就可以产生明显的细胞病变,同时可以被抗HAV血清中和。甲型肝炎病毒1～3214碱基编码衣壳蛋白,脊髓灰质炎病毒2A蛋白参与抑制宿主蛋白质翻译,因此重组株既具有甲型肝炎病毒的抗原性,又具有较强的感染能力。由于宿主细胞不能提供小RNA病毒RNA复制所需的所有因子,所以病毒感染后首先合成自身RNA复制的必需因子。感染后10～15分钟,病毒编码的多聚蛋白开始合成。首先由2A蛋白酶将多聚蛋白水解成P1和P2+P3,3C蛋白酶再将P2和P3分别水解成单体—2A、2B和2C以及3A、3B、3C和3D。3D为RNA依赖的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制。在无细胞体系中,用正链RNA为模板合成病毒负链RNA,证明病毒RNA复制至少需要3种蛋白质,即病毒蛋白3D、VPg和分子量为67000Da的宿主蛋白HP。VPg含有VPgpUpU结构,因此可以做为引物与正链RNA3末端的Poly(A)结合,再由病毒蛋白3D沿正链模板合成负链RNA。2B和2C蛋白也可能参与病毒RNA的复制。
位于衣壳表面突出的氨基酸多与抗体结合有关,称为中和抗体结合区,又称NIm(Neutralizingimmunogen)。鼻病毒的4个NIm区分别称为NImⅠA(位于VP1)、NImⅠB(位于VP2)、NImⅡ(位于VP2)和NImⅢ(位于VP3)。这些NIm区分散于亚单位的不同部位,为突出于表面的环。根据每个免疫原与周围氨基酸的关系,可以将其分为两部分:一部分为环突部,其氨基酸不与周围氨基酸直接接触;另一部分为环交部,其氨基酸直接与邻近氨基酸接触。以NImⅡ的主环为例,VP2氨基酸第153～155(GID)和164～166(GPV)为环交部,而156～163(LSSANEVG)为环突部。环突部为抗体结合部位,环交部起着维持环突部空间构型的作用。
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