不同小RNA病毒株间的基因重组研究已经有20多年历史。近年来由于PCR技术的应用,研究深度和广度有了明显的提高。一般认为,自然界病毒基因的变异与病毒的基因重组有一定的关系。病毒重组研究的目的在于了解自然界病毒变异的机理和规律,同时探讨在实验室内制备重组疫苗的可能性。小RNA病毒重组研究往往使用两个不同的基因标志株,如温度变异株(ts株)、壳粒蛋白点突变株等。用两个毒株同时感染细胞,分离单个病毒蚀斑,挑选病毒克隆,再利用母株的两个不同基因标志筛选重组株。已经发现病毒基因重组发生在负链合成过程中。部分合成的病毒负链RNA与RNA聚合酶一同从原母株正链RNA模板上转移到另一个母株正链RNA模板上,继续完成整条负链RNA的合成。由重组的负链病毒RNA再合成正链RNA,重组正链RNA翻译重组病毒蛋白,再将正链RNA装配到病毒衣壳中,从而产生重组病毒株。根据排列组合推算,病毒RNA包装过程可以出现多种情况。Pp1、Pp2和Gp1.2分别代表两个母株衣壳和重组衣壳,PR1、PR2和GR1.2代表两个母株和重组株RNA。三种病毒RNA都能被包装进入三种不同的毒株衣壳中,产生9种病毒粒子:PR1+PP1、PR1+PP2、PR1+GP1.2;PR2+PP2、PR2+GP1.2;GR1.2+PP1、GR1.2+PP2、GR1.2+GP1.2。其中只有GR1.2+GP1.2为真正的重组株。因此必需经过多次蚀斑克隆,才能得到三种病毒株,即PR1+PP1、PR2+PP2、GR1.2+GP1.2。显然,只有第三种为重组株。小RNA病毒RNA重组可以在很多位点上发生。脊髓灰质炎病毒重组位点的总碱基数为病毒RNA的12%,口蹄疫病毒为3%,可见重组频率是相当高的。Kind(1988)通过对重组株与母株的血清型鉴定发现,所有的病毒RNA分子在一个复制周期中可以产生10%～20%的重组RNA(GR1.2)。病毒RNA复制误差约104/碱基,即平均每条病毒RNA链上有一个碱基错误。幸而,99%以上的突变RNA不能继续复制,因此自然界中病毒的变异相对缓慢。已经证明,不仅在实验室可以制备重组病毒,在自然界同样可以发现病毒基因重组。从自然界分离的脊髓灰质炎病毒株的核酸序列分析中发现,某些毒株含有所有三种口服疫苗株的核酸片段。可能由于三种疫苗株同时感染肠道中的一个细胞而产生了三个母株间的RNA重组。从小RNA病毒的基因重组和自然点突变的发生率来看,不难理解为什么小RNA病毒有如此众多的亚型。随着病毒的进化、减毒活疫苗的增加和大型集约化饲养的发展趋势,可能会不断出现人们从未发现过的新亚型、新型以至于新种、新属的小RNA病毒。
我们曾对不同属之间小RNA病毒基因重组进行过较为细致的研究。试验使用口蹄疫病毒属的O型口蹄疫病毒株和猪肠道病毒。两株病毒均可以在IBRS2细胞中复制。口蹄疫O型株可以感染BHK21,但猪肠道病毒则不能。如前所述,口蹄疫病毒在pH62以下迅速失去感染力,而猪肠道病毒在pH3～10却十分稳定地保持感染能力。试验首先用口蹄疫病毒和猪肠道病毒对IBRS2细胞进行双重感染。收集病毒培养液,加01mol/LNaH2PO4调节pH至58,置4℃12小时。试验证明经pH58处理,口蹄疫病毒被灭活,但不影响猪肠道病毒的感染活性。调节病毒液pH至74,并感染BHK21细胞。经3次传代,发现具感染活性的病毒存在。猪肠道病毒不能感染BHK21细胞,口蹄疫病毒已经pH58灭活,因此出现的病毒可能是两母株的重组株。小RNA病毒对低pH的耐受性与壳粒蛋白(VP1、2、3)有关,因此重组位点可能在P1区。重组病毒液经5次蚀斑克隆后得到100个克隆株。抗口蹄疫和抗猪肠道病毒抗体双重标志筛选证明,重组株具有两母株的抗原性。用重组株接种乳鼠,发现其毒力比口蹄疫母株下降10000倍。以未经灭活的重组株接种猪,不能引起口蹄疫,但可以诱导猪产生抗口蹄疫病毒抗体。试验证明免疫猪可以耐受100ID50剂量的口蹄疫病毒攻击。由于口蹄疫病毒保护性抗原决定簇位于VP1141～160号氨基酸残基上,因此重组株可能保留了这部分基因。病毒蛋白SDS电泳显示重组株的VP1略大于两母株,并与两母株的抗体结合(Westernblot),说明重组株VP1可能是口蹄疫和肠道病毒VP1的融合蛋白。重组株VP2、3能与口蹄疫病毒抗体反应,不能与肠道病毒抗体反应,说明RNA重组发生在VP1基因中间：即重组病毒RNA5末端至VP1中部来源于肠道病毒,VP1中部下游来源于口蹄疫病毒。另外,病毒的细胞膜受体结合位点在VP1203~213氨基酸残基上,重组株可以感染BHK-21细胞,因此病毒RNA应该保留口蹄疫母株病毒的这段序列。对重组株部分cDNA与两母株的核酸序列进行分析比较,证明病毒RNA重组确实发生在VP1基因上。
口蹄疫病毒的L蛋白参与抑制宿主蛋白合成反应(水解P220),肠道病毒则由2A蛋白参与这一反应。重组株RNA5末端由肠道病毒RNA取代,不含口蹄疫病毒的L蛋白基因,VP13末端为口蹄疫病毒基因,不含肠道病毒的2A蛋白,这也许是重组株对宿主细胞蛋白合成抑制减弱,对动物毒力降低的原因之一。这个试验证实在小RNA病毒中,不同属间也可能发生基因重组,产生新病毒。但重组率可能远低于同属病毒间的重组。根据现有的小RNA病毒基因图谱和病毒蛋白生物活性等资料,可以在实验室内较为合理地设计重组试验,准确地发现重组位点以及合理地分析、解释甚至预测重组株的生物学活性,从而可为病毒疫苗的制备、病毒基因的定位和分子流行病学分析提供更多的研究手段。近年来美国学者使用PCR技术对小RNA病毒重组进行了大量的研究,使人们更加深入地了解重组频率、位点、条件等多方面的资料。
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