口蹄疫病毒免疫 动物在自然感 染口蹄疫病毒耐过以后,具有相当坚强的免疫力。牛耐过口蹄疫后具有一年半左右的免疫性 。猪的病后获得性免疫可达10~12个月,豚鼠为3~4个月。隐性感染动物也有免疫力。免疫 强度与血液中的 中和抗体水平相符。初期抗体为IgM,开始出现于感染后的第9天，但仅保持一个月。IgG抗体 出现于感染后10～14天，并可长期持续几个月到一年以上。这两种免疫球蛋白都有明显的中 和及抗感染作用。但是必须指出，上述免疫只对同型病毒有效。在口蹄疫流行地区，在疫情 停息后几个月至1年左右时间内再次暴发疫情，大多是由异型或同型中不同亚型的毒株引起 。注射恢复动物的全血、血浆或血清，可以产生被动免疫，保护易感动物不受感染。但免 疫期甚短，一般不超过2周，主要用于疫情暴发时对仔猪和犊牛等提供紧急保护。免疫或 恢复动物的抗体，可以通过初乳传递给仔畜。初生犊牛血清中没有免疫球蛋白，但在吸吮免 疫母牛的初乳后2小时，即可在其血清中测出抗体。这种母源抗体的存在，固然具有一定的 抗感染作用，但也可使犊牛对活毒疫苗接种不发生反应，导致免疫注射无效。人工免疫注射包括弱毒疫苗和灭活疫苗两种。弱毒疫苗常可提供较好的免疫力，免疫持续 时间也 较长。除能引起循环抗体以外，还使接种动物产生某种程度的局部免疫，例如在唾液和鼻分 泌物中出现分泌性IgA。弱毒疫苗剂量小，价格低廉，兔化或鼠化等弱毒疫苗甚至可在基层 单位就地制造。但是必须指出，目前所用的弱毒疫苗的致弱程度，常随动物种类而不同，例 如对牛没有毒力或毒力很低的疫苗株，可能对猪仍有致病力。即使在牛，弱毒疫苗株对于不 同品种、年龄和生理状态(如怀孕)的动物也常表现不同的残留毒力。弱毒疫苗中的活病 毒可能在畜体和肉品内长期存在，构成疫病散布的潜在威胁，而病毒在多代通过易感动物后 可能出现的毒力增强——返祖，更是一个不可忽视的危险。因此，许多欧洲国家以及北美、 澳 大利亚、新西兰等没有口蹄疫疫情的国家和地区均已明文规定禁止使用弱毒活疫苗。南美一 些国家曾经使用弱毒疫苗，但因欧洲的肉食进口国家提出异议，现已大多停用。我国亦已开 始禁用弱毒活疫苗。
防制口蹄疫，目前大致采取三种方法：
(1)广泛进行免疫预防，也就 是对所有的易感动物进行系统的预防注射；
(2)如果疫区不大，疫点不多，在经济条件许可 的情况下，扑杀疫区内的病畜和易感动物，并在周围10公里内进行环形预防注射，也就是所 谓的包围圈式免疫预防；
(3)在很少发 生或没有口蹄疫的国家和地区，一旦发生疫情，采取断然措施，扑杀疫区内所有的牲畜，彻 底消毒。采取上述三种方法中的哪一种，决定于疫情流行情况以及社会—经济条件等许多因 素。发达国家都是采取检疫、封锁、屠杀和消毒等措施防制和消灭疫病。疫苗接种对牛具有较好的保护力，但猪的免疫力的产生远比牛为困难。用于猪的口蹄疫疫 苗 ，特别是灭活疫苗中的含毒量必须比牛大3～10倍，且应加有皂素、明矾或油包水型乳剂等 佐剂。
弱毒活疫苗— 目前应用的弱毒疫苗株包括鼠化、兔化、鸡胚化以及组织 培养细胞驯化毒等，各学者所用的原始毒种以及驯化培育的方法和条件不尽一致。还有以人 工诱变或突变体筛选等方法选育的弱毒株，如温度敏感(ts)株等。由于这些毒株在致弱程度 和免疫原性上都还不够理想，因此驯化工作仍在继续，而且往往交叉进行，例如将鼠化毒株 再 经鸡胚、组织培养细胞或兔体传代以及将兔化毒株进一步通过组织培养细胞等等。目前有关 这些疫苗株的毒力、免疫原性和实际应用方面的报道较多，但互相间存在一些矛盾，甚至比 较明显的矛盾。故在应用上述疫苗进行免疫注射时，必须严格遵照各该疫苗的使用说明以及 保存和运输规定。由于口蹄疫的广泛流行以及防疫上的大规模需要，弱毒疫苗在免疫效力 和经济上都曾有过很高的吸引力，特别是在应用弱毒疫苗成功地消灭或控制了天花、黄 热病等先例的鼓舞下，许多实验室开展了口蹄疫弱毒苗的研究。但是实践结果往往不够理想 。虽然许多学者应用不同的毒株进行了各种途径的传代驯化及纯株(克隆化)病毒的挑选，先 后培育出了多达几十个弱毒疫苗株。但是可以这样认为，迄今还无一个可以满足所有要求标 准的口蹄疫弱毒疫苗株。理想的弱毒疫苗株应该致弱程度适当，能在动物体内增殖，引起较 好的免疫反应，但又不致产生机体损伤，多代通过敏感动物，毒力不会增高，而且可以应用 于牛、羊、猪等多种动物。而在现有的几十个弱毒疫苗株中，或则毒力过弱，缺乏免疫原性 ；或则毒力过高，经常引起机体损伤，以至明显的发病症状；有的在实验室内证明没有毒力 ， 但在应用于不同生理应激水平的动物，例如怀孕、泌乳的母牛以及犊牛和仔猪，往往可以致 病，甚至引起死亡。应用寡核苷酸指纹图谱分析以及等电聚焦电泳等技术，发现80年代发生 于欧洲的几次口蹄疫流行均与疫苗毒株有关，例如在1984～1985年意大利发生的口蹄疫流行 中，分离的毒株与疫苗株A5 parma 62有关；1984年暴发于前西德的口蹄疫由疫苗A5 Al lier 60所致；82年暴发于丹麦和前西德慕尼黑的口蹄疫是由疫苗毒株O1 Ausamn 65引起 的……等等。且如上述，对一种动物的减毒，并不保证对其它动物的减毒。再者，由于新的 病毒亚型不断地自然出现或从其它地区传入，而毒株致弱的结果以及达到致弱所需的时间， 却都不能预言，不能适应防制新亚型的需要。因此，尽管弱毒疫苗株的驯化培育研究仍在继 续，并已开始应用基因重组等新技术，但在许多国家和地区，口蹄疫的预防接种几乎都是采 用灭活疫苗。
灭活疫苗— 关于灭活疫苗的制造方法，大致可分为四个阶段。
①1939年，Sc hmidt和Waldmann等将口蹄疫病毒接种于屠宰前健康牛的舌皮内，待其发病后，采取病牛 舌部的水疱皮和水疱液，加入氢氧化铝凝胶进行吸附，随后再用甲醛灭活，制得了具有较高 免疫保护力的疫苗。这种疫苗量少价贵，饲养病牛又有严重散毒的危险，现已摒弃不用。
②1947年，Frenkel从新屠宰的健康牛舌上采取上皮组织，迅速剪碎后，置于培养罐内， 同时加入营养液和病毒，使病毒在存活的上皮组织片内大量增殖，随后加入灭活剂和佐剂制 成疫苗。Frenkel疫苗提供了大规模生产疫苗的方法。在口蹄疫，特别是欧洲口蹄疫的防制 上起到过重要的作用。
③1962～1963年，Ubertini等应用犊牛肾细胞在大罐内培养口蹄疫 病毒，生产出大量优质疫苗。1962年，Mowat和Chapman等开始应用乳仓鼠肾传代细胞(BHK 21)培养口蹄疫病毒，并制造疫苗。
④1966年，Capstick和Telling等建立了应用BHK 21细胞深层悬浮培养法制备口蹄疫疫苗的基本方法。随着生产工艺的改进，现在已可成功地 应用容量达800万ml以上的大发酵罐大量培养细胞、增殖病毒和制造疫苗。英国于1984年 在Pirbright建立了国际疫苗库，可为其成员国紧急生产灭活疫苗，保存有A24、O1 、C1和Asial等亚型的疫苗病毒株，在液氮中贮存可供50万头牛用的疫苗浓缩制剂，并配 备有迅速 配制和分装疫苗的实验室。定期用牛和豚鼠监测其保护力，进行一系列生物学试验。保存一 年的疫苗没有发生任何降解。深层悬浮培养法应用密闭系统的大发酵罐培养细胞。以改良 Eagle氏液作为培养液，用自动调节的滤过空气和二氧化碳控制酸碱度。细胞在不断搅拌的 悬浮状态下增殖，温度自动调节为36℃左右。最常应用的细胞是适于悬浮培养的BHK21克 隆 13细胞株，但也有应用IFFA3细胞或IBRS2细胞的。当细胞数增殖至3×106/ml时，即 可接种病毒，并于接毒后20~30小时收毒，此时病毒滴度一般可达107~108TCID50 /01ml。于病毒液内加入乙酰乙烯亚胺(AEI)作灭活剂，以氢氧化铝或皂素为佐剂，制成灭 活疫苗。除上述悬浮培养方法以外，也有应用BHK21等的单层细胞培养物增殖病毒，随 后加入甲醛、二乙烯亚胺(BEI)或β丙内酯等灭活剂灭活，并以氢氧化铝、皂素、弗氏不 完全佐剂 或油包水型乳剂等作为佐剂疫苗。应用微载体或中空纤维培养技术，可使单位体积内的细 胞密度比悬浮培养法高几倍到几十倍，从而得以明显提高培养病毒的滴度。具体方法请参阅 本书第十一章有关节段。西欧最近发现，近年来的许多次口蹄疫暴发似与灭活疫苗中的残 留活病毒有关。其它地区也有类似报告。这种情况促进了亚单位疫苗的制备研究，亦即制造 只含病毒蛋白而无病毒核酸的口蹄疫免疫制剂。Kupper等成功地制备和浓缩了口蹄 疫病毒的衣壳蛋白VP1。法国和美国的研究工作者也已证明，由破裂的病毒粒子中提取的 纯化VP1能够使豚鼠和猪发生抗体反应，大剂量时更能使猪获得对随后感染的免疫力。 在应用基因工程制备口蹄疫疫苗方面，亦已取得明显突破。许多 国家先后报道过口蹄疫病毒免疫原性蛋白VP1核苷酸序列的克隆和表达，表达产物能使 被接种动物产生一定程度的免疫保护力。以反转录酶由口蹄疫病毒RNA合成单股cDNA，再用D NA聚合酶使其复制成双股。在与质粒DNA重组后引入大肠杆菌进行扩增。提取内含插入基因 的质粒，以限制内切酶切取插入基因副本，除去不必要的碱基序列后，再行插入表达质粒， 并转化大肠杆菌，使其表达并产生病毒蛋白。每个细菌约能产生106个LEVP1分子， 相当于菌体重量的17%。用少数猪、牛作免疫接种试验，表现有保护作用。Bittle氏等(19 82年)化学合成了VP1 141~160号氨基酸的合成肽与钥孔 虫 戚 血兰蛋白(KLH)偶联，具有较好的免疫原性，开创了合成肽疫苗的光辉前景。应 用VP1 141～158号和200～213号氨基酸组成的40个氨基酸的合成肽即使没有载体，也能产 生对牛的较 好的保护力。根据141～160和200～213号肽段是决定免疫原性的抗原活性簇，郑兆鑫等(1 994)合成了编码该两肽段的基因片段，构建了编码带有Lac启动子和编码590个氨基酸的β 半乳糖苷酶基因的表达质粒，在酶基因的C末端与排列为AA140～160AA200～213AA 141～160的口蹄疫病毒串联基因相连结。重组质粒转入大肠杆菌后，能表达具有免疫原性的 抗 原蛋白。用含抗原融合蛋白包涵体400ug二次注射豚鼠，45天后的保护率100%，160天后为66 7%;给猪注射二次，分别含抗原融合蛋白的包涵体53mg和34mg，60天后的保护率为100 %，143天后为80%。Mckenna等(1995)通过基因工程技术,构建了一株缺失RGD(精氨酸甘氨酸天门冬氨酸)的 口蹄疫病毒,由于RGD是病毒蛋白衣壳上负责与细胞结和的特异部位,因此,缺失RGD就消除了 病毒结合细胞的能力。应用这种缺失受体结合位点的口蹄疫病毒给牛接种,可以使其产生抵 抗强毒株攻击的免疫力。
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