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黑穗醋栗组织培养和遗传转化一



录入时间:2009-7-1 15:08:49 来源:青岛海博

摘要:通过对不同激素质量浓度配比实验,建立黑穗醋栗茎尖高频再生体系。结果表明,Ms + 6-BA1.0mg/L  + NAA 0.1 mg/L,培养基可高效诱导黑穗醋栗茎尖的分化,1 / 2 MS 培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。25 mg/L 卡那霉素可以抑制茎尖的分化,20 mg/L ,卡那霉素可以抑制分化小苗的生根。利用农杆菌介导法将osMAPK4 基因转化黑穗醋栗,获得了抗卡那霉素的再生植株。提取转基因植株基因组DNA ,进行PCR 检测,结果表明。,MAPK4 基因已经被整合到黑穗醋栗基因组中。
关键词:黑穗醋栗;组织培养;遗传转化
黑穗醋栗,又名黑加仑,黑醋栗,黑茶蔺子,为虎耳草科茶蕉子属小灌木,是东北地区广泛栽培、营养丰富、风味独特、资源雄厚的北方浆果。其钙含量为水果之冠,维生素C 的含量比一般水果高出几十至几百倍,其含有的类黄酮有延缓衰老、增强人体免疫力、降血脂、改善动脉硬化和防癌抗癌的作用。但黑穗醋栗属于多年生木本果树,世代周期长,杂合性高,许多重要经济性状属于多基因控制的数量性状,遗传机理不明,利用常规的方法进行品种选育困难重重。利用基因工程手段将外源基因导入作物中,培育出新的品种已成为现代农业和农作物育种的发展方向。但是黑穗醋栗属于木本果树,离体培养技术还不完善,再生有困难,常常无法获得再生植株,并且缺乏高效的遗传转化方法。针对以上问题,我们以黑穗醋栗为试材进行组织培养和遗传转化的初步研究,以期为黑穗醋栗组织培养和遗传转化提供一定的依据。
1
材料和方法
1.l
材料
以黑穗醋栗品种布劳德(Brodtorp)茎尖为转化的外植体,取自东北农业大学园艺试验站。实验使用根癌农杆菌菌株LBA4404 ( Rifr , Kmr ) ,由东北农业大学生命科学学院植物生物工程研究室提供,质粒载体pBME12 含有osMAPK4 基因,PE12 启动子,及NPTⅡ基因,质粒图谱见图1
1.2
方法
1.2.1
黑穗醋果茎尖再生体系的建立
采取越冬前至早春萌芽前la 生枝条上的腋芽作为外植体,首先将带芽茎段用流水冲洗干净,然后在超净工作台上按下列程序消毒:70 %酒精305 " 0.1 %升汞15 min 一无菌水冲洗4 5 次,除去叶芽外层苞片拨取0.2 mm 左右的茎尖。
将茎尖接种于附加不同激素的MS 培养基上诱导萌芽。每处理接种60 个芽,3 次重复,培养30d 后将培养茎尖转至增殖培养基,待苗高约2 3 cm 时,再分别转人生根培养基生根,每处理接种60 个芽,3 次重复。培养温度为(25 2 )℃ ,光照强度2000lx ,每天光照12~ 14h
1.2.2
农杆菌介导法对黑穗醋果茎尖的遗传转化
将茎尖外植体放于分化培养基上预培养ld ,然后放于转化用的菌液中,浸泡15~20min。用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液,然后转至MS 固体培养基上,28 共培养3d ,共培养pH 值为5.2 。共培养后,用含有拍100 mg/L,阿莫西林的MS 液体培养基冲洗,离心去上清,用无菌滤纸吸干植物材料表面液体,转至含有100 mg/L 阿莫西林的MS 培养基上除菌。每7d 继代1 次。将除菌2 次以后的植物材料转至含有100 mg/L阿莫西林的MS 固体培养基上继续进行转化筛选及除菌。2 周继代1 次,并同时诱导抗性植株。对抗性植株进行PCR 检测,用osMAPK4 基因序列的引物进行PCR 检测,引物如下:
sense : 5 ' AAGCTYGCCATAGATFCAATYCAATC 3 '
antisense : 5 ' GATCCAAACCAAAGCTTTTTTTCTTTCC3 '

 

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