2 结果与分析
2.1 黑穗醋栗茎尖再生体系的建立
2.1.1 黑穗醋果茎尖培养基的确定实验设计了多种用于茎尖分化增殖的培养基，以便筛选出最适合的激素配比。从表1 可以看出，布劳德休眠芽茎尖培养的分化率，在各培养基之间差异不显著，1 号培养基茎尖增殖系数最高。茎尖在1 号、2 号、7 号和8 号培养基上获得增殖系数显著高于其他培养基。在选择茎尖培养时，要求茎尖在该培养基上具有较高的分化频率和增殖系数，同时要求所培育的无菌苗生长势强，并且有较强的生根能力。尽管1 号培养基分化率和增殖系数较高，但得到的分化苗节间较长，生长势弱，经多次继代容易玻璃化，并且很难生根。茎尖在7 号和8 号培养基上都具有较高的分化率和增殖系数，而且得到的试管苗长势较好，容易生根。因为7 号培养基6-BA 质量浓度较低，所以确定黑穗醋栗茎尖分化和增殖最佳培养基为7 号培养基（基本培养基是MS ，蔗糖3 % ，琼脂0.8 % , pH 5.8 , 6-BA mg/L, NAA 0.l mg/L）。
2.1.2 黑穗醋果生根培养基的确定
取生长健壮的再生植株，切除其基部的愈伤组织，然后接种在生根培养基上，探讨适宜的生根培养基（表2 ) , IBA 质量浓度对黑穗醋栗再生苗生根率具有一定的影响。试管苗在1 号和2 号培养基上具有较高的生根率，同其他培养基相比较差异显著。其原因可能是高浓度IBA 使试管苗基部形成大量愈伤，从而抑制根的形成。2 号培养基IBA 浓度为0.1 mg/L，在试管苗基部也产生了少量愈伤，影响了试管苗的生根质量。1号培养基没有添加植物生长调节剂，但其仍具有较高的生根率，而且生根质量较好，因此确定黑穗醋栗再生苗生根培养基为l 号培养基（MS / 2 ）。
2.2 黑穗醋栗茎尖培养筛选压力的确定
2.2.1 卡那霉素对黑穗醋栗茎尖分化的影响
将外植体接种到含卡那霉素质量浓度O 、25 、50 、75 、100 mg/L的芽诱导培养基上进行培养，统计分化结果。根据初筛选结果设置第2 次卡那霉素质量浓度梯度，确定最佳的筛选质量浓度。初步试验结果表明，Km 质量浓度在25 mg/L时，已完全抑制了茎尖分化。因此，在此基础上，重新设置质量浓度梯度，分别为：o 、15 、20 、25 、30 mg/L。结果表明，Km 在25 mg/L时，即能完全抑制茎尖的芽再生（表3 ）。因此确定Km 的最适质量浓度为25 mg/L。
2.2.2 Km 对黑穗醋果试管苗生根的影响
将外植体接种到含卡那霉素质量浓度0、25 、50 、75 、100 mg/L的芽诱导培养基上进行培养，统计分化结果。根据初筛选结果设置第2 次卡那霉素质量浓度梯度，确定最佳的筛选质量浓度。初步试验结果表明，Km 质量浓度在25 mg/L时，已完全抑制试管苗根的发生。因此，在此基础上，重新设置质量浓度梯度，把Km 设0 、10 、15 、20 、25 mg/L, 5 个质量浓度梯度来探讨其对生根率的影响。表4 结果表明Km 在20 mg/L时，即能完全抑制试管苗根的发生。因此确定Km 生根的最适质量浓度为20 mg/L。
2.3 农杆菌介导法转化黑穗醋栗
共培养3d的茎尖含有100 mg/L阿莫西林的液体培养基除菌后，转到100 mg/L阿莫西林的固体除菌培养基上，培养15d 后转到含100 mg/L卡那霉素的筛选培养基上筛选。筛选3 一4 周得到抗性芽，待抗性芽长至2 一3 cm 高时，将其转至含有卡那霉素的生根培养基上进行2 次筛选，2 周后即可生根，获得抗性植株。1 500 个外植体共获得23 个抗性植株，待根系发达后进行驯化移栽。
以质粒PBME12 （含osMAPK4基因）为阳性对照，无菌水为阴性对照，未转化植株DNA 代替模板DNA 为负对照，以抗性植株总DNA 为模板，用osMAPK4基因序列的引物进行PCR 检测。只有4 株抗性植株扩增出与目的基因大小一致的条带，转化率为0.27 ％。
从PCR 产物电泳结果图（图2 ）可见，选取的抗性苗DNA 经引物扩增后产生与阳性对照相同的约1700bP 的特异扩增带，与osMAPK4 基因的外源片段大小相符，而非转基因对照中未见相应扩增带。这初步说明外源基因已整合进黑穗醋栗的基因组中。
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