轮状病毒属（Rotavirus）[HT5K〗 同义名：双层病毒（Duoviruses） 轮状病毒是各种幼龄动物非菌性腹泻的主要病原之一。最早于1968年由 Mebus 等在美国内布拉斯加州一农场犊牛腹泻病例中发现，欧、美洲各国以及澳大利亚、 新西兰和日本等都发现了牛轮状病毒引起的犊牛腹泻，澳大利亚和英、美等国均报 道有轮状病毒引起的仔猪腹泻。此外，在绵羊、山羊、幼驹、鹿以及兔和小鼠等 也有发生轮状病毒性腹泻的报道。小鼠的流行性腹泻就是轮状病毒引起的。鸡 和火鸡等多种禽类中亦有轮状病毒感染的存在。我国亦有猪、牛、羊、犬和多种禽类等轮 状病毒感染的报道，并已发现或分离鉴定了病毒。轮状病毒感染引起严重的经济损失。以英国为例，犊牛轮状病毒性腹泻的发病率 为60%～80%，死亡率为0%～50%，1%～4周龄仔猪群的发病率超过80%，死亡率7%～20%。轮状病毒感染引起的腹泻是一种世界性传染病。据初步统计，全世界幼儿发生的肠炎至少有 50%是 由轮状病毒引起的。该属代表种为人轮状病毒，其它成员包括从人、牛、小鼠（EDIM）、豚鼠、绵羊、山羊、猪 、猴（SA11）、马、羚羊、北美野牛（Bison）、鹿、家兔、犬、禽的分离株。
[BT4]1. 形态特征病毒粒子略呈圆形，具有双层衣壳。直径为65～75nm。中央为一个电子致密 的六角形核心，直径37～40nm。周围绕有一个电子透明层。轮状病毒曾被描 述为类呼肠孤病毒，但可根据它们清晰明确的光滑外缘与呼肠孤病毒相区别。壳 粒由此向外呈辐射状排列，构成内衣壳。外周为一层由光滑薄膜构成的外衣壳， 厚约20nm，外衣壳可能是在内质网膜上芽生时获得的。以核心为毂，以呈辐射状排列的内 衣壳为轮辐，以外衣壳为辋，构成了特征性的轮状结构。轮状病毒这一名称，就 由此而来。有关轮状病毒的超微结构，学者们的意见尚不一致。曾提出过内 衣壳有３２个、１３２个、１６２个、１８０个、３２０个壳粒构成呈２０面 体排列的多种模型。Martin等（1975）认为轮状病毒与环状病毒一样，也有32个大的环形壳粒，且其180个三联亚单位 按T=9方式组成20个三角面体。每个三联亚单位包含3个结构单位，所以一共有540 个结构单位。但据Esparza（1978）报道，轮状病毒表面有162个孔，由320个三联 亚单位按T=9方式组成20个三角面体。因每个三联亚单位包含三个结构单位，所 以一共有960个结构单位。[HT5”SS][JZ]图19-3 轮状病毒（横杠=100nm） [CD2]自 杨盛华[HT]出现上述不同的观察结果，也许是标本制作方法不同的缘故。现公认轮状病毒为二十面体，三角剖分数T=13。Stannard等（1977）对乳鼠流行性腹泻轮状病毒和猴轮状病毒SA11株进行了 细致的电子显微镜观察，发现其内衣壳有180个形态亚单位，排列成晶格状。12个 顶各为一个空隙，由5个壳粒围绕，另外80个空隙各由6个壳粒围绕。外衣壳由蜂 窝样的晶格组成，且与内衣壳的晶格排列相符。 Stannard还绘制了一幅有关 轮状病毒衣壳结构的模式图，见图1９-4。除完整的病毒粒子（称为光滑型，即S颗粒）外，还常可以见到没有外衣壳的病毒粒 子，称为粗糙型，即R颗粒。形成无感染性的或感染性差的单层衣壳壳粒，这种颗粒 ，比完整病毒粒子小，其出现的相 对频率甚低，但已发生在鸡、仔猪、犊牛和人类的感染中，约占仔猪轮状病毒感染的５％，而在牛则低至１％。此外还有空衣壳。在已感染的小 肠上皮细胞的胞浆内，常有无定形的毒浆（viroplasm）和微管样结构（其表面形态 与病毒粒子相同），可能是病毒衣壳异常合成的产物。[HT5”SS][JZ]图19-4 轮状病毒衣壳结构模式[JY,16][CD2]自Stannard[HT][BT4]2. 理化学特性轮状病毒粒子和核心在氯化铯密度梯度中的浮密度分别为136～138g/cm3和144g/cm3。S20w=525。病毒由11个节段的双链RNA组成，大小为06×103～33×103kDa。以Nebraska株轮状病毒为例，各节段的分子量分别 为221、185、170、155、100、082、051、051、026、0 20和020×103kDa。RNA占病毒粒子重量的12%～15%。短的保守序列全在5′末端。轮状病毒ＲＮＡ的１１个节段，在聚丙烯酰胺凝胶电泳后，易于分开，形成特定的电泳带组合模 式，即电泳图型模式，简称电泳型。这１１条带分为４个区段。常见的动物和 人的轮状病毒的４个区段中，各带的排列位置为４∶2∶3∶2，统称Ａ群。根据 第１０和第１１节段之间距离的长短，又分长型和短型。后来又发现了一些新 的轮状病毒，其电泳型与Ａ群不同，称为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ和Ｆ群，见表19-3和 图19-5。[HT5”H][JZ]表19-3 轮状病毒分群特征[HT6SS][BG(!][BHDFG2,WK6,K14,K11,K20ZQW]群 群特异性抗原 电 泳 型 [JZ]宿 主[BHDG10]ABCDEF[]ABCDEF[]4∶2∶3∶24∶2∶2∶34∶3∶2∶25∶2∶2∶24∶2∶2∶33∶3∶3∶2[]多种动物和人猪、牛、大鼠、中国成人、小儿小儿、猪禽猪禽[BG)F][HT][HJ]尽管不同的血清型可能呈现相似的电泳型，而同一血清型又可能显示不同的电 泳型，但国内外迄今还常应用电泳分型法作为鉴定轮状病毒的主要手段。[HT5”SS][JZ]图19-5 轮状病毒RNA的电泳型[HTSS][JZ][WB]A. 常见轮状病毒，长型，4∶2∶3∶2[DW]B. 常见轮状病毒，短型，4∶2∶3∶2[DW]C. 非典型轮状病毒，5∶2∶2∶2[HT]应用聚丙烯酰胺凝胶电泳，可在不同毒株间发现RNA节段的电泳迁移图谱有一定 程度的差异，不同种动物的轮状病毒之间的差异更明显。其中最重要的是根据第10和11 节段之间距离的长短划分的所谓长型与短型。一些A群轮状病毒具有血凝性，例如牛NCDV株能凝集人O型以及豚鼠、马、绵羊等红细 胞。绵羊和人株能凝集鸡、绵羊、兔、豚鼠及人的红细胞。我国江苏省的分离株能凝 集豚鼠、马、人O型、绵羊及犊牛红细胞。最适pH72～74，温度为37℃，血细胞浓度 为05%。血凝和血凝抑制试验亦可提供一种毒株分类方法。轮状病毒对环境因子和许多常见消毒剂如碘附和次氯酸盐有较强的抵抗力，能耐 受乙醚、氯仿和去氧胆酸钠处理而不影响其感染性。对酸（pH30）和胰酶稳定，56 ℃ 30分钟使其感染力降低2个对数。1mol/L MgCl2 不能增高其对56℃ 60分钟 的稳定性。粪便中的病毒在18～20℃室温中，经7个月仍有感染性。能耐1%甲醛1 小时以上。10％聚维酮碘（povidoneiodine）、９５％乙醇和6７％氯胺Ｔ是有效消毒剂。总的说来，蛋 白水解酶如胰凝乳蛋白酶，能增强轮状病毒和正呼肠孤病毒的感染性，由于轮状病毒 对外界环境因素及消毒剂作用有抵抗力，所以当清洗和消毒畜禽舍时必须注意到 这个特点。
[BT4]3. 抗原性病毒粒子表面有３种抗原，即群抗原、中和抗原及血凝素抗原。群抗原与多种 结构蛋白有关，主要是由第6节段编码的内壳蛋白Vp6；中和抗原主要是由第9节段编码的外壳糖蛋白Vp7；血凝素抗原是由第4节段 编码的外壳蛋白Vp4，可被蛋白水解酶水解。不是所有的轮状病毒都有血凝 素。根据群抗原的差异及病毒RNA末端指纹图的分析将轮状病毒分为A～F 6个群。绝大多数哺乳动物轮状病毒，具有一种相同的群抗原。这些轮状病毒被命名为A 群或典型轮状病毒，包括大多数哺乳动物和禽A群轮状病毒，是研究的主要对象。B～F群只在原代宿主上生长，为非典型轮状病毒或副轮状病毒(pararotavirus），缺乏 共同抗原，其基因片段只有第5、7、9节段RNA；其中B群出现在人、猪、牛、绵羊和大鼠， 在 我国发现的成人轮状病毒是重要代表；C群在猪，很少见于人，D群和F群在禽，E群在猪。禽轮状病毒与哺乳动物无抗原相关性。尽管用免疫荧光、ELISA、补结试验、琼扩等方法检测群抗原，但同群轮状病毒仍有不 同的抗原。此种抗原可用血清中和试验或蚀斑减数中和试验鉴别。根据中和抗 原Vp7的差异可将A群轮状病毒分为14个血清型，分别用阿拉伯数字G1～11 标记；依据Vp4差异大约有８个血清型，标记为p1～8，它们间有部分抗原交叉。
[BT4]4. 培养尽管最初分离的几个轮状病毒株如猴的SA11株、牛的Nebraska株和O株都易在细 胞培养中增殖，但在应用胎肠器官培养以及胎肠单层细胞和胚肾等许多原代或细 胞系单层细胞培养物分离和增殖其它一些轮状病毒时，如牛、猪和人的轮状病毒时，都常不易成功或则增殖率不高，或则不易传代。Banatvala等（1975）将培养有猪肾细胞的盖玻片置于平底塑料管底，待其长 成单层后，接种婴儿粪滤液，并以3 000r/min离心沉淀2小时，随后置37℃培养。24小 时后用荧光抗体染色，发现有阳性荧光细胞，同样培养接种，但未离心沉淀的细胞 培养物却呈阴性结果。Bryden等（1977）和Bridger（1981）也证明离心沉淀物可以提高轮状病毒的阳 性分离率，但仍不能使轮状病毒在细胞培养物中连续传代。培养轮状病毒使用最普遍的是MA104（恒河猴胎肾传代细胞系），其它敏感细胞尚 有AGMK（原代非洲绿猴肾细胞）、CMK（一种猴的原代肾细胞以及CV1（非洲绿猴 肾细胞系）。火鸡和鸡等禽轮状病毒的初次分离也可用雏鸡肾或鸡胚肝细胞的原 代培养物。某些禽A群轮状病毒既能够感染未致敏的禽脾淋巴细胞。又能感染禽 淋巴母细胞转化细胞系。连续转动培养有利于分离和复制轮状病毒。为了在细胞培养中复制轮状病毒和连续传代，通常需要用胰蛋白酶处理激活。Clask 等（1981）建议病毒需经10μg/ml胰酶处理和无血清培养基维持，认为这对感染是必需的。胰蛋白酶的活性受保存时间、不同的生产批号等因素的影响。因此，建议在接种 病毒之前，可以先测定维持液中胰蛋白酶的需要量。方法是在维持液中加入不同 浓度的胰蛋白酶（通常为05、10、15……10μg/ml），当旋转培养中的MA104细胞 长成单层后，不要接种病毒，而是换上加有胰蛋白酶的维持液。一般在数小时之内， 高浓度的胰蛋白酶将引起细胞单层脱壁。24小时之后，最适浓度的胰蛋白酶至少应 有50%的细胞单层未脱壁。关于胰蛋白酶促进轮状病毒感染性的机理，可能是由于对细胞的直接影响或破坏 了病毒增殖的抑制物。现大多趋向认为，轮状病毒复制方式不同于其它呼肠孤病毒， 它不是通过吞饮作用进入细胞，而是通过胞浆膜直接进入胞浆，其穿入依赖于Vp4 。这一过程是通过胰酶作用于Ｖp4，特异性裂解成Vp５和Vp8（6 ０kDa，28kDa），从而使病毒变为有感染性。 类似于流感病毒和副流感病毒在蛋白酶作用后，囊膜的糖蛋白被消除而使其感染 力活化。轮状病毒的转录同其它正呼肠孤病毒一样。胰蛋白酶处理不能使人的 轮状病毒在细胞培养中适应。除某些牛、猪轮状病毒株外，其它动物的轮状病毒在细胞培养物中增殖时，一般不 产生细胞病变，或只产生轻微而不稳定的细胞病变。大多数初代 分离物需要在细胞培养物中连传几代才能见到细胞致病作用。细胞病变表现为 细胞肿大变圆、脱落、颗粒增多、细胞变暗，有时出现融合灶及拉网现象。但 有时仅表现粗糙感，细胞并不脱落。有的毒株不产生细胞病变，需要用荧光抗体 法等手段检测。轮状病毒也可产生蚀斑，Matsuno等（1977）报道，覆盖琼脂中 含有胰蛋白酶时，轮状病毒可以形成蚀斑，最佳配方据报道为乙酰化胰酶 （3μg/ml）、DEAEDextran（50μg/ml）以及06%纯化琼脂。除A型轮状病毒外，其它轮状病毒的许多毒株迄今未能适应细胞培养，分离的成功率 约在40%～70%，因此有时只能用经口感染易感动物来分离和复制病毒。自情侣鹦 鹉分离的一株轮状 病毒，经卵黄囊接种可致死鸡胚。至目前为止，没有有关其它禽轮状病毒在鸡胚 中增殖的文献报道。悉生仔猪、悉生羔羊可用来增殖猪、犬、猴、马、牛或人的病毒。更 为理想的动物模型是小鼠，4～14日龄抗体阴性者感染率可高达95%，牛、猴或人的 毒株均可诱发腹泻。
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