轮状病毒属 7. 诊断由于人和动物的轮状病毒感染极为普遍，而动物的临床发病及其血清中的抗体 效价又无明显的线性平行关系，因此，抗体测定在轮状病毒感染的现症诊断上 的价值不大，只能说明感染率。即使应用双份血清亦然。有谓血清中IgM的含量 与感染的关系比较密切，IgM测定可能具有较大的现症诊断意义。病畜在腹泻时随粪排出大量病毒，每克排泄物中有时含有高达109～10个病毒粒子。因此可用粪滤液接种敏感的组织培养细胞来分离病毒。如果扑杀1头典型 病畜，采取小肠后段的肠内容物作病毒分离，效果更好。由于排泄物或肠内容物 中的病毒含量较高，也为病毒粒子或病毒抗原的直接检出提供了可能性。
（1）电镜观察 采取腹泻粪汁或后段小肠内容物10ml，用015mol/L pH76磷酸盐缓 冲盐水作1∶4稀释，倾入盛有玻璃珠的灭菌玻瓶中，充分振荡30分钟。吸取悬液， 以3 000r/min离心沉淀20分钟，除去粗大的纤维和颗粒。吸取上清液，再以10 000r/min 离心沉淀30分钟。将上清液用灭菌G6号玻璃滤器或孔径为022μm的滤膜过滤， 再以38 000r/min超速离心沉淀90分钟。倾弃上清液，将沉淀物研磨或用超声波处理， 悬浮于几滴蒸馏水中，并滴加于铜网上，用磷钨酸负染后镜检。根据轮状病毒的特 征性形态进行识别。也可将病料标本置-20℃冻融处理，加入等量蒸馏水，如上充分振荡混匀，用粗铜 网初滤后作为悬液。于1份悬液中加入1份三氯三氟乙烷（CCl2FCClF2）， 振荡混合30分钟，或置组织捣碎器中高速处理2×2分钟（10 000r/min）。收集混合 悬液，以3 000r/min离心沉淀20分钟，吸取上清液，再用10 000r/min离心沉淀30分钟，并 以G6号玻璃滤器或孔径为02２μm的滤膜过滤。收集滤液，以38 000r/min离心沉淀90 分钟，如上滴加于铜网上，负染后镜检。据Fleweett报道，每毫升粪汁标本中含有105个病毒粒子时，仔细 观察可能看到病毒粒子；每毫升标本内含106个病毒粒子时，一般都能获得阳 性电镜结果；每毫升标本中的病毒粒子超过108个时，那就极易作出诊断。如果粪汁标本中的病毒粒子太少，电镜难以检出，可将上述已经初步浓缩提纯并 准备滴加于铜网的病毒悬液，再用密度梯度离心沉淀法进一步浓缩。先在离心沉 淀管内加入氯化铯溶液作垫，并在其上层加10%～30%蔗糖溶液，最上层加病毒悬液， 离心沉淀后吸取氯化铯垫表面的浓缩病毒液，滴加于铜网上，如上负染和镜检。 有关密度梯度离心沉淀和电镜技术的具体方法，请参考本书第十二章和第十三章。一个更为简单但敏感性较差的电镜检查方法，已经成功地用于粪便中轮状病毒的 检出。先将腹泻粪汁作3 000r/min离心沉淀30分钟，吸取上清液，加入等量氯仿，充 分振荡混合，再次3 000r/min离心沉淀30分钟，吸取上清液，直接滴加于铜网上，负染 后镜检。有谓病料中的呼肠孤病毒和轮状病毒的形态相似，电镜下不易区别。根据我们经 验，两者在形态结构上并不完全相同，仔细观察不难加以区别：①轮状病毒的内 衣壳的壳粒为棍棒状，向外呈辐射状排列，构成内衣壳，外周为一层由光滑薄膜构 成的外衣壳，故而病毒表面光滑；相反，呼肠孤病毒内衣壳的壳粒接近球形或呈短 棱柱状，外衣壳的壳粒清楚可见，故整个病毒的表面呈粗糙颗粒状；② 轮状病毒的核心较小，直径为３７～４０nm，而呼肠孤病毒的核心较大， 直径为４０～４５nm。
（２）免疫电镜观察 先行制备免疫血清，即以上述提纯的轮状病毒，加入 等量弗氏不完全佐剂后，多次肌肉注射家兔或豚鼠，并于末次注射后一个月采 血，析得血清。也可应用病畜、禽恢复期血清。必要时可用几个动物的混合血 清。在粪滤液中加入免疫血清，使病毒粒子与抗体结合而发生凝集，电镜检查可见 成堆的病毒粒子。具体方法是在１份粪滤液内加入４份１∶５０稀释（视抗体 效价的高低可适当调整）的免疫血清或恢复期血清。稀释血清需先用Ｇ６号 玻璃滤器或孔径为０２2μm的滤膜过滤。振荡混合后置３７℃感作３０～６０ 分钟，再置４℃过夜。翌晨以１０ ０００ｒ/min离心沉淀３０分钟。倾弃上清 液，将沉淀物如上悬浮于几滴蒸馏水或管壁残留液中，随后滴加于铜网上进行 负染和镜检。阳性标本中通常具有较多的成堆病毒粒子。如果病毒粒子破损， 则应考虑进一步提高免疫血清的稀释度或者缩短其感作时间。也可先用抗轮状病毒免疫血清或恢复期血清（以猪为例）如上进行感作处理，离 心沉淀后将沉淀物重新悬浮于少量（05～1ml）兔抗猪IgG内，如上感作、离 心沉淀、滴样和镜检。
（3）特异性荧光细胞检出 将腹泻粪汁适当稀释后，于载玻片上作成涂片。３７℃干燥２０分钟后，用冷丙酮固定１０分钟，随后用荧光素标记的特异抗 体（IgG）于室温下染色３０分钟，彻底冲洗后，置荧光显微镜下检查荧光细胞 。或者先用兔抗轮状病毒抗体感作处理，随后再用荧光素标记的抗兔IgG进行间 接法染色。如果扑杀１头典型病猪（犊牛），刮取空肠和回肠的柱状上皮制作涂片，更 易检出大量荧光细胞。在实验感染动物，通常在接种后４小时即可在小肠粘膜 上皮细胞内看到病毒抗原，最大量的感染细胞出现于接种后１６～２４小时 。此后减少，接种后１８０～３４０小时就很难找到阳性荧光细胞。
（４）病毒分离 以猪的轮状病毒为例。如上制备粪滤液，加胰蛋白酶处 理后，接种已经长成单层的ＭＡ１０４细胞和猪肾ＰＫ１５细胞。生长液为 内含05%乳白蛋白水解物和１０％犊牛血清的ＥＭＥＭ。倾弃营养液后，种 入粪滤液，３７℃感作吸附１小时，吸弃接种物，换入不含血清的维持 液。３７℃孵育１８～２４小时，即可应用直接或间接法荧光抗体检出荧光细 胞。或在接种后４８～７２小时收获培养物，经超声波和胰蛋白 酶处理后接种已经冲洗的新的单层细胞，３７℃吸附１小时后，吸弃接种物， 再如上换入不含血清的维持液。维持液内也应加入胰蛋白酶。
（５）放射免疫测定 Middleton等应用放射免疫夹心间 接法直接检测粪标本中的轮状病毒抗原。敏感性比电镜检查病毒粒子高１０倍 以上，且已成功地用于临床标本。先用兔抗轮状病毒抗体包被聚苯乙烯小管，随 后加入５×稀释粪汁在离心沉淀后吸取的上清液，冲洗后加入豚鼠抗轮状 病毒抗体，感作并冲洗后，最后加入125Ｉ标记的兔抗豚鼠抗体。详细方法 见本书第十四章。
（６）ELISA测定 原理与上述放射免疫测定相同，仅以辣根过氧化物酶标记 抗体代替125I标记抗体，并经底物显色后进行判定。具体方法请见本书第 十四章。ELISA试验是一种敏感而特异的试验，使用范围广。商品化试剂盒 通常检查Ａ群轮状病毒。
（７）包被红细胞固相凝集试验 本法已经成功地用于粪便中轮状病毒的检 测。先用抗轮状病毒抗体包被聚苯乙烯Ｕ型微量滴定板的孔，洗涤后加入以Ｐ ＢＳ１０×稀释的待检粪便，37℃感作１小时，反复洗涤后，加入氯化铬 交联的抗轮状病毒抗体包被的绵羊红细胞，并按常规血凝试验的判定方法进行 判定，请参阅本书第十四章。现在用乳胶颗粒代替红细胞制作的乳胶凝集商品 化试剂盒，直接用于检查轮状病毒，这种方法是特异且比电镜敏感的快速诊断 方法，能诊断出临床感染。
（８）中和试验 主要用于鉴别轮状病毒的种属特异性，也就是识别其动 物来源。通常是在微量培养板上培养ＰＫ１５细胞、ＭＡ１０４细胞或猴肾 传代ＬＬＣ ＭＫ2细胞。每孔02ml，内含5×104个细胞。待其长成 单层细胞后，接种不同稀释度的粪滤液或病毒悬液，每孔５０μl。３７℃孵育２４小 时后用荧光抗体检查荧光细胞。选择每５０μl中含有１０4个以上荧光 细胞单位的粪滤液或病毒悬液作为抗原。正式试验时，将粪滤液或病毒悬液稀释至１００～２００荧光细胞单位／５ ０μl，加入等量倍比稀释的兔抗轮状病毒抗体，３７℃感作１小时后，分别 加入于微量培养板各孔的细胞培养物内，置３７℃孵育１８～２４小时。随后 如上用荧光抗体染色，以能减少５０％荧光细胞的血清稀释度为判定终点。血 清的稀释倍数即其中和效价。免疫血清对同源病毒的中和效价通常比异源病毒 高４倍以上。0
（９）补体结合试验 可用已知血清鉴定病毒，也可应用已知抗原检测动物 血清中的抗体。如上述，补体结合试验只能检出各种动物轮状病毒的共同抗原， 没有鉴别病毒种属来源的能力，故只用于轮状病毒的初步鉴定。抗原以病畜禽 粪汁制备，即取腹泻粪汁，在ＰＢＳ中作成１０～２０％（Ｖ／Ｖ）悬液， 以７ ０００r/min离心沉淀２０分钟，吸取上清液，再以３８ ０００r/min超 速离心６０分钟。取沉淀物悬浮于少量ＰＢＳ中即成。必要时还可用超声波适 当处理。另以健康动物粪便同样处理后制成正常对照抗原。
（１０）病毒核酸电泳法 用于直接检测轮状病毒感染，并同时能鉴定出病 毒基因组的电泳型，是研究轮状病毒分类学和流行病学的最常见方法。通常将 病料或感染的培养物冻融处理后，经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样 品后，从轮状病毒中提取ＲＮＡ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），银染 ，根据病毒ＲＮＡ节段的数目及图式即可作出判断。血清学分析一般检查不出 同一型轮状病毒的微小差异，但ＰＡＧＥ法可以检出。如果粪样中病毒含量高，应用下述简单的核酸提取方法，也可获得满意的电泳 鉴定结果。取粪液025ml，加入Eppendorf管中，再加等量２％ＳＤＳ溶液，振 荡混合３０秒钟，立即加入苯酚氯仿混合液05ml，如上振荡混合。１０ ０ ００r/min离心沉淀５分钟，吸取上层水相，即为核酸样品，立即进行电泳。加 样时，取核酸样品２０～４０μl，加样品稀释液３０～６０μl，混匀后即将Eppendorf 管放入９０℃水浴加热２分钟，随后滴加凝胶板。电泳电压为３００～５００ Ｖ或用７０～１００ＭＡ电流量，电泳１小时后用１０％乙醇、０５％乙酸固 定１５分钟，并以硝酸银染色后观察。
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