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轮状病毒属(三)



录入时间:2009-7-3 10:37:54 来源:青岛海博

轮状病毒属 7. 诊断由于人和动物的轮状病毒感染极为普遍,而动物的临床发病及其血清中的抗体 效价又无明显的线性平行关系,因此,抗体测定在轮状病毒感染的现症诊断上 的价值不大,只能说明感染率。即使应用双份血清亦然。有谓血清中IgM的含量 与感染的关系比较密切,IgM测定可能具有较大的现症诊断意义。病畜在腹泻时随粪排出大量病毒,每克排泄物中有时含有高达109~10个病毒粒子。因此可用粪滤液接种敏感的组织培养细胞来分离病毒。如果扑杀1头典型 病畜,采取小肠后段的肠内容物作病毒分离,效果更好。由于排泄物或肠内容物 中的病毒含量较高,也为病毒粒子或病毒抗原的直接检出提供了可能性。
(1)电镜观察 采取腹泻粪汁或后段小肠内容物10ml,用015mol/L pH76磷酸盐缓 冲盐水作1∶4稀释,倾入盛有玻璃珠的灭菌玻瓶中,充分振荡30分钟。吸取悬液, 以3 000r/min离心沉淀20分钟,除去粗大的纤维和颗粒。吸取上清液,再以10 000r/min 离心沉淀30分钟。将上清液用灭菌G6号玻璃滤器或孔径为022μm的滤膜过滤, 再以38 000r/min超速离心沉淀90分钟。倾弃上清液,将沉淀物研磨或用超声波处理, 悬浮于几滴蒸馏水中,并滴加于铜网上,用磷钨酸负染后镜检。根据轮状病毒的特 征性形态进行识别。也可将病料标本置-20℃冻融处理,加入等量蒸馏水,如上充分振荡混匀,用粗铜 网初滤后作为悬液。于1份悬液中加入1份三氯三氟乙烷(CCl2FCClF2), 振荡混合30分钟,或置组织捣碎器中高速处理2×2分钟(10 000r/min)。收集混合 悬液,以3 000r/min离心沉淀20分钟,吸取上清液,再用10 000r/min离心沉淀30分钟,并 以G6号玻璃滤器或孔径为022μm的滤膜过滤。收集滤液,以38 000r/min离心沉淀90 分钟,如上滴加于铜网上,负染后镜检。据Fleweett报道,每毫升粪汁标本中含有105个病毒粒子时,仔细 观察可能看到病毒粒子;每毫升标本内含106个病毒粒子时,一般都能获得阳 性电镜结果;每毫升标本中的病毒粒子超过108个时,那就极易作出诊断。如果粪汁标本中的病毒粒子太少,电镜难以检出,可将上述已经初步浓缩提纯并 准备滴加于铜网的病毒悬液,再用密度梯度离心沉淀法进一步浓缩。先在离心沉 淀管内加入氯化铯溶液作垫,并在其上层加10%~30%蔗糖溶液,最上层加病毒悬液, 离心沉淀后吸取氯化铯垫表面的浓缩病毒液,滴加于铜网上,如上负染和镜检。 有关密度梯度离心沉淀和电镜技术的具体方法,请参考本书第十二章和第十三章。一个更为简单但敏感性较差的电镜检查方法,已经成功地用于粪便中轮状病毒的 检出。先将腹泻粪汁作3 000r/min离心沉淀30分钟,吸取上清液,加入等量氯仿,充 分振荡混合,再次3 000r/min离心沉淀30分钟,吸取上清液,直接滴加于铜网上,负染 后镜检。有谓病料中的呼肠孤病毒和轮状病毒的形态相似,电镜下不易区别。根据我们经 验,两者在形态结构上并不完全相同,仔细观察不难加以区别:①轮状病毒的内 衣壳的壳粒为棍棒状,向外呈辐射状排列,构成内衣壳,外周为一层由光滑薄膜构 成的外衣壳,故而病毒表面光滑;相反,呼肠孤病毒内衣壳的壳粒接近球形或呈短 棱柱状,外衣壳的壳粒清楚可见,故整个病毒的表面呈粗糙颗粒状;② 轮状病毒的核心较小,直径为37~40nm,而呼肠孤病毒的核心较大, 直径为40~45nm。
(2)免疫电镜观察 先行制备免疫血清,即以上述提纯的轮状病毒,加入 等量弗氏不完全佐剂后,多次肌肉注射家兔或豚鼠,并于末次注射后一个月采 血,析得血清。也可应用病畜、禽恢复期血清。必要时可用几个动物的混合血 清。在粪滤液中加入免疫血清,使病毒粒子与抗体结合而发生凝集,电镜检查可见 成堆的病毒粒子。具体方法是在1份粪滤液内加入4份1∶50稀释(视抗体 效价的高低可适当调整)的免疫血清或恢复期血清。稀释血清需先用G6号 玻璃滤器或孔径为022μm的滤膜过滤。振荡混合后置37℃感作30~60 分钟,再置4℃过夜。翌晨以10 000r/min离心沉淀30分钟。倾弃上清 液,将沉淀物如上悬浮于几滴蒸馏水或管壁残留液中,随后滴加于铜网上进行 负染和镜检。阳性标本中通常具有较多的成堆病毒粒子。如果病毒粒子破损, 则应考虑进一步提高免疫血清的稀释度或者缩短其感作时间。也可先用抗轮状病毒免疫血清或恢复期血清(以猪为例)如上进行感作处理,离 心沉淀后将沉淀物重新悬浮于少量(05~1ml)兔抗猪IgG内,如上感作、离 心沉淀、滴样和镜检。
(3)特异性荧光细胞检出 将腹泻粪汁适当稀释后,于载玻片上作成涂片。37℃干燥20分钟后,用冷丙酮固定10分钟,随后用荧光素标记的特异抗 体(IgG)于室温下染色30分钟,彻底冲洗后,置荧光显微镜下检查荧光细胞 。或者先用兔抗轮状病毒抗体感作处理,随后再用荧光素标记的抗兔IgG进行间 接法染色。如果扑杀1头典型病猪(犊牛),刮取空肠和回肠的柱状上皮制作涂片,更 易检出大量荧光细胞。在实验感染动物,通常在接种后4小时即可在小肠粘膜 上皮细胞内看到病毒抗原,最大量的感染细胞出现于接种后16~24小时 。此后减少,接种后180~340小时就很难找到阳性荧光细胞。
(4)病毒分离 以猪的轮状病毒为例。如上制备粪滤液,加胰蛋白酶处 理后,接种已经长成单层的MA104细胞和猪肾PK15细胞。生长液为 内含05%乳白蛋白水解物和10%犊牛血清的EMEM。倾弃营养液后,种 入粪滤液,37℃感作吸附1小时,吸弃接种物,换入不含血清的维持 液。37℃孵育18~24小时,即可应用直接或间接法荧光抗体检出荧光细 胞。或在接种后48~72小时收获培养物,经超声波和胰蛋白 酶处理后接种已经冲洗的新的单层细胞,37℃吸附1小时后,吸弃接种物, 再如上换入不含血清的维持液。维持液内也应加入胰蛋白酶。
(5)放射免疫测定 Middleton等应用放射免疫夹心间 接法直接检测粪标本中的轮状病毒抗原。敏感性比电镜检查病毒粒子高10倍 以上,且已成功地用于临床标本。先用兔抗轮状病毒抗体包被聚苯乙烯小管,随 后加入5×稀释粪汁在离心沉淀后吸取的上清液,冲洗后加入豚鼠抗轮状 病毒抗体,感作并冲洗后,最后加入125I标记的兔抗豚鼠抗体。详细方法 见本书第十四章。
(6)ELISA测定 原理与上述放射免疫测定相同,仅以辣根过氧化物酶标记 抗体代替125I标记抗体,并经底物显色后进行判定。具体方法请见本书第 十四章。ELISA试验是一种敏感而特异的试验,使用范围广。商品化试剂盒 通常检查A群轮状病毒。
(7)包被红细胞固相凝集试验 本法已经成功地用于粪便中轮状病毒的检 测。先用抗轮状病毒抗体包被聚苯乙烯U型微量滴定板的孔,洗涤后加入以P BS10×稀释的待检粪便,37℃感作1小时,反复洗涤后,加入氯化铬 交联的抗轮状病毒抗体包被的绵羊红细胞,并按常规血凝试验的判定方法进行 判定,请参阅本书第十四章。现在用乳胶颗粒代替红细胞制作的乳胶凝集商品 化试剂盒,直接用于检查轮状病毒,这种方法是特异且比电镜敏感的快速诊断 方法,能诊断出临床感染。
(8)中和试验 主要用于鉴别轮状病毒的种属特异性,也就是识别其动 物来源。通常是在微量培养板上培养PK15细胞、MA104细胞或猴肾 传代LLC MK2细胞。每孔02ml,内含5×104个细胞。待其长成 单层细胞后,接种不同稀释度的粪滤液或病毒悬液,每孔50μl。37℃孵育24小 时后用荧光抗体检查荧光细胞。选择每50μl中含有104个以上荧光 细胞单位的粪滤液或病毒悬液作为抗原。正式试验时,将粪滤液或病毒悬液稀释至100~200荧光细胞单位/5 0μl,加入等量倍比稀释的兔抗轮状病毒抗体,37℃感作1小时后,分别 加入于微量培养板各孔的细胞培养物内,置37℃孵育18~24小时。随后 如上用荧光抗体染色,以能减少50%荧光细胞的血清稀释度为判定终点。血 清的稀释倍数即其中和效价。免疫血清对同源病毒的中和效价通常比异源病毒 高4倍以上。0
(9)补体结合试验 可用已知血清鉴定病毒,也可应用已知抗原检测动物 血清中的抗体。如上述,补体结合试验只能检出各种动物轮状病毒的共同抗原, 没有鉴别病毒种属来源的能力,故只用于轮状病毒的初步鉴定。抗原以病畜禽 粪汁制备,即取腹泻粪汁,在PBS中作成10~20%(V/V)悬液, 以7 000r/min离心沉淀20分钟,吸取上清液,再以38 000r/min超 速离心60分钟。取沉淀物悬浮于少量PBS中即成。必要时还可用超声波适 当处理。另以健康动物粪便同样处理后制成正常对照抗原。
 
(10)病毒核酸电泳法 用于直接检测轮状病毒感染,并同时能鉴定出病 毒基因组的电泳型,是研究轮状病毒分类学和流行病学的最常见方法。通常将 病料或感染的培养物冻融处理后,经差速离心、蔗糖密度梯度离心制备病毒样 品后,从轮状病毒中提取RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),银染 ,根据病毒RNA节段的数目及图式即可作出判断。血清学分析一般检查不出 同一型轮状病毒的微小差异,但PAGE法可以检出。如果粪样中病毒含量高,应用下述简单的核酸提取方法,也可获得满意的电泳 鉴定结果。取粪液025ml,加入Eppendorf管中,再加等量2%SDS溶液,振 荡混合30秒钟,立即加入苯酚氯仿混合液05ml,如上振荡混合。10 0 00r/min离心沉淀5分钟,吸取上层水相,即为核酸样品,立即进行电泳。加 样时,取核酸样品20~40μl,加样品稀释液30~60μl,混匀后即将Eppendorf 管放入90℃水浴加热2分钟,随后滴加凝胶板。电泳电压为300~500 V或用70~100MA电流量,电泳1小时后用10%乙醇、05%乙酸固 定15分钟,并以硝酸银染色后观察。

 

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