鸡传染性支气管炎病毒
7.培养传染性支气管炎病毒能在鸡胚、器官培养的鸡胚气管以及来自鸡和鸡胚的多种细胞培养物 内生长。初代分离最好应用鸡胚。(1)鸡胚：一般采用9～11日龄鸡胚的尿囊腔接种。最初几代鸡胚极少发生变化，随着传代次 数的增加，鸡胚死亡率增高，鸡胚病变明显。至10代时，可使80%鸡胚死亡。主要病变为 鸡 胚停止生长，卷曲呈球形，即所谓卷曲胚。羊膜水肿增厚，紧贴鸡胚，尿囊液增量，卵黄囊 皱缩，肾中尿酸盐沉着，鸡胚发生肝坏死、肺炎和肾炎。病毒也能在绒毛尿囊膜上增殖， 但不产生病斑。尿囊腔接种后36小时，病毒的最高滴度可达107个鸡胚致死量。一般以绒毛 增殖曲线，常因培养温度和毒株而异。将接种病毒后的鸡胚置34℃孵育时，至少需延长30小 时，才能达到38℃孵育时的效价，而且仅有20%鸡胚死亡。(2)器官培养：器官培养的气管在分离传染性支气管炎病毒上的用途，尚未充分肯定，但 已有应用气管培养研究这种病毒的报道，例如用其作为中和试验的指示系统等等。传染性支 气管炎病毒感染的体外培养气管，其纤毛细胞变圆脱落，纤毛运动停止。(3)细胞培养：鸡传染性支气管炎病毒能在15～18日龄鸡胚的肾细胞、肺细胞及肝细胞培 养物内生长。其中以肾细胞最敏感，其次是肺细胞、肝细胞和鸡胚成纤维细胞。低代次的鸡 胚分离株在细胞培养物上生长不良或不生长。6～10代的鸡胚传代毒株，在肾细胞培养物上 能产生常见的细胞病变，但某些毒株即使在细胞培养物上连传10代，也只产生轻度病变。主 要细胞病变为出现融合细胞和细胞坏死。一般于接毒后6小时，即可见到融合细胞， 18～24小时左右，可能出现几十乃至100个以上核的巨大融合细胞，细胞最后死亡。在 碱性条件下，细胞病变出现较早，而且较广泛。在肝细胞培养物中的融合细胞较小，肺细胞 培养物中的融合细胞不明显。细胞培养物内的病毒浓度于24～36小时达最高峰。已经 适应鸡胚的某些毒株还能在猴肾细胞培养物(如Vero细胞)上传代，并产生融合细胞和蚀斑 ，但不能在其它哺乳动物细胞系统中传代。鸡传染性支气管炎病毒在易感宿主细胞的胞浆内复制。感染后6～15小时，发育的病毒粒子 开始由胞浆内呈新月形向空泡腔凸现。当病毒粒子成熟时，空泡膜结合入病毒的外套。尚未 见有从细胞膜表面出芽的现象。鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞上形成蚀斑，蚀斑数目与接种剂量成线性关系。培养时 应保持8%CO2和85%的相对湿度。蚀斑抑制技术是测定鸡血清抗体水平的1种准确方法。
8.病原性在自然条件下，鸡传染性支气管炎病毒感染各种年龄的鸡，主要侵害1～4周龄的雏鸡和幼鸡 。病毒经气管内接种后，首先在呼吸道内增殖，经18～36小时的潜伏期后发病。主要症状为 精神 不振，呼吸困难，气管口[KG-*8]罗音， 咳嗽，喷嚏。病程6～18天。幼鸡的病死率约25%，雏鸡可达75 %～90%。6周以上的鸡通常不死亡。产蛋鸡的产蛋量下降，并常产出软壳蛋和畸形蛋，蛋的 质量降低。某些毒株，如马萨诸塞株可引起鸡的肾病。给7日龄雏鸡进行人工气管内感染，约经2～3天的潜伏期，常出现甩鼻、抓鼻和口[KG-*8]罗音以及伸颈张嘴喘气等呼吸道症状。幼鸡的病理变化是鼻窦炎、卡他性气管炎、支气管炎、肺充血和水肿，偶而气囊混浊增厚。 鼻道中常有卡他性渗出物，支气管内有干酪样堵塞物。由侵害肾脏的毒株致病时，肾脏肿 大，苍白，肾小管和输尿管内充满尿酸盐结晶。在实验条件下，适应鸡胚的别但泰株(Beaudette)和马萨诸塞株在脑内接种乳鼠时，引起 神经麻痹并死亡。给2日龄兔作脑内接种，也可引起感染。雉也可感染，常与支原体或细菌等发生混合感染。火鸡静脉内接种，可保持48小时的病毒 血症。豚鼠对IBV感染有抵抗力。尚未发现感染组织的细胞内有病毒包涵体。
9.生态学鸡传染性支气管炎病毒具有高度的感染力，在鸡群中传播迅速，几天内即可波及全群。感 染后 从呼吸道分泌物排出病毒长达2周，粪便排毒3周以上(Moore等1977年报道，粪便排毒可达数 月)。病毒也可存在于感染鸡的精液和急性期病鸡所产的蛋内。康复鸡可带毒35天。曾有人 从实验感染后49天的隔离幼鸡中检出病毒。疾病主要通过病鸡咳出的飞沫经呼吸道 传播，也可通过污染的饲料、饮水和饲养用具引起间接传播。某些学者认为经病鸡蛋传播是 暴发本病的重要原因。
10.免疫自然感染和人工感染都可获得自动免疫。感染后第3周，产生大量中和抗体。康复鸡可获得 约1年的免疫力。自然感染或人工感染后恢复的母鸡，其蛋内存在母源抗体，能给 新孵出的 雏鸡提供天然获得性免疫。这种雏鸡的血清抗体可保持14天，以后逐渐降低、消失。被动免 疫只能减轻疾病的症状，不能预防本病毒的呼吸道感染。本病的免疫接种，经历过不同的历史阶段。最初(1941)是用比较良性的野外毒株接种鸡群 中的7～15周龄幼鸡，使其自然传播而获得免疫，以减少经济损失。此法接种反应较重，并 有长期散毒危险。以后改用灭活疫苗多次接种的方法，但免疫效果不理想。现在多用鸡胚化 弱毒疫苗接种。弱毒疫苗是由抗原性良好的毒株连续通过鸡胚25代以上获得的。一 般认为选用马萨诸塞型作为疫苗株较好，因为马萨诸塞型能对异型毒株也产生较好的免 疫力，其次是康涅狄格疫苗株。疫苗株的致弱程度，随具体需要而定。肉用鸡要求早期接种 ，不需长期免疫，因此疫苗株的病原性要很低，只要能够产生短期的免疫力就可达到目 的。产蛋鸡和种鸡宜选用免疫期较长的疫苗株。疫苗接种的年龄，肉用鸡于生后1周第 1 次接种，至1月龄时再接种1次。种鸡及产蛋鸡应于2～4周龄接种疫苗。一般于接种后2～3 周产生较强的免疫力。疫苗接种方法有喷雾法、喷粉法和饮水法。最常用的是饮水法，其缺 点是疫苗受环境条件的影响较大，以致影响免疫效果。当前存在的主要问题是疫苗株还有一 定的致病性和传播能力，接种疫苗后引起轻度的呼吸道反应。当鸡群中存在致病性支原体 时 ，会成为慢性呼吸道病暴发的激发因素。另外，传染性支气管炎病毒的血清型之间 经常缺乏交叉保护，或者交叉保护性不强，因此，应用疫苗之前，应对疫苗株与当地流行毒 株之间的免疫学关系有所了解，国外已有双价疫苗的生产。目前广泛应用H120和H 52株弱毒疫苗，前者适用于1～3周龄雏鸡的初次免疫；后者适用于5～15周龄的青 年鸡的第2次免疫。均用滴鼻法或饮水法接种。两次免疫接种后的免疫期约1年。关于鸡传染性支气管炎疫苗株与鸡新城疫疫苗株联合制苗的问题，学者们存在不同意见。Ma rkham等认为鸡传染性支气管炎疫苗和鸡新城疫疫苗联合应用，不致互相干扰； 而Hanson等和Raggi则认为两种疫苗联合应用有干扰作用，主张单独 使用。
11.诊断根据雏鸡或幼鸡的急性、高度接触性呼吸道感染和高病死率以及母鸡产蛋量显著降低和产畸 形蛋等病史，可作出推测性诊断。最后确诊需进行病毒分离和血清学试验。(1)病毒分离：①检样的采取和处理：肺、支气管和气管是病毒增殖的最初部位，是分离传染性支气管炎病 毒的适宜材料。但在感染后10～14天，就不易从这些部位分离获得病毒(少数带毒鸡可能带 毒1 个月以上)。在感染初期分离病毒，应取气管拭子，浸泡于每毫升含有1 000U青霉素和1 00 0U链霉素的2ml肉汤内。在有肾病变的病例，如果怀疑有传染性支气管炎病毒存在，分 离病毒时还应包括肾脏，但其含毒量较低。实验性感染鸡传染性支气管炎病毒的病鸡，可在 感染后12～ 49天内发现病毒。分离时间愈早，分离成功率愈高。组织应无菌采取，用乳钵、玻璃组织研 磨器或超声波处理后，稀释和悬浮于胰蛋白磷酸盐肉汤或pH72的缓冲盐水中，每毫升含1 000U青霉素和1 000mg/mL链霉素，并置室温感作30分钟。也可用庆大霉素硫酸盐，用量为 每毫升100～200μg。由于病毒血症的时间很短，血液不是分离病毒的理想材料。②病毒分离培养：病料要尽快进行病毒分离，否则应低温冰冻保存。初代分离培养最好用鸡 胚。将如上制备的材料接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔内。鸡胚可能于接种后的7天内死亡， 或发育停滞，羊膜增厚或纤维变性，或在中肾出现尿酸盐沉着。因为新分离的鸡传染性支气 管炎病毒在最初几代鸡胚中常不引起发育停滞和死亡，可能看不到病变。所以最好在接种后 48～72小时收获1～2个鸡胚的尿囊液并接种另1组新的鸡胚。剩下的鸡胚则继续孵育7天， 检查传染性支气管炎的典型病变。这样的盲目传代，至少进行3代。已经适应鸡胚 的病毒在接种鸡胚肾细胞培养物时，常能良好生长。主要的细胞病变是出现合胞体。合胞体 的体积和数目随孵育时间的延长而增加，最后发生坏死。③病毒鉴定：取初代鸡胚尿囊液，经气管接种于易感雏鸡，如为本病，则在接种后18～36小 时出现气管口[KG-*8]罗音，用同型特异 抗血清可抑制这种致病作用，从而作出鉴定。另外，据 Raggi等(1975，1976)报道，给鸡胚预先接种传染性支气管炎病毒，随后再接种鸡新城 疫病毒B1株，可以干扰B1株产生血凝素。而且传染性支气管炎病毒的这种干扰作用， 能被同型特异抗血清所抑制，故可作为传染性支气管炎的1种诊断方法。根据同样原理， 也可在鸡胚肾细胞培养物上进行这种干扰试验，以检测试验血清中是否存在传染性支气管炎 病毒的抗体，即在细胞单层上加入连续2倍稀释的试验血清和等量传染性支气管炎病毒感染 鸡胚尿囊液的混合液，37℃孵育30小时之后，再用106EID50鸡新城疫病毒接种培养 物，继续放37℃孵育，检查鸡新城疫病毒的致细胞病变作用。鉴定本病毒的最常用方法是病毒中和试验，即用已知的抗传染性支气管炎血清与新分离毒株 在9～11日龄鸡胚上进行中和试验，出现中和反应即可证实其同一性，不出现中和反应，就 说明是不同血清型的传染性支气管炎病毒或者不是传染性支气管炎病毒。鸡传染性支气管炎 病毒的中和试验有固定病毒稀释血清法和固定血清稀释病毒法两种，请参阅本书第十四 章有关内容。
(2)血清学试验：①病毒中和试验：应用已知的病毒检查待检血清中的特异性抗体。分别采取病初和2～3周 后的双份血清，同时测定两份血样对鸡传染性支气管炎病毒的中和抗体效价，如第二次(康 复期)血样的中和抗体滴度高于第1次血样4倍以上，即可诊断为鸡传染性支气管炎。②荧光抗体试验：可用于鸡传染性支气管炎病毒感染的快速诊断——检测急性病鸡气管涂片 中的鸡传染性支气管炎病毒。取气管上皮涂片，在空气中干燥，丙酮固定后，用荧光抗体 在37℃湿盘中染色15～30分钟。将染片在pH72缓冲盐水中涮洗，而后干燥，滴加缓冲盐水 和甘油的等量混合液，盖上盖玻片，即可在荧光显微镜下检查。因在各个血清型之间具有某 些交叉反应性，所以荧光抗体不能鉴别到型。③琼脂扩散试验：用感染的鸡胚绒毛尿囊膜悬液制备的抗原，放置在琼脂板的中央孔内， 将待检血清加在邻近的孔中，然后观察这两孔之间的沉淀线。病后至少7天血清中才出 现沉淀抗体，持续20～94天。比较疾病早期和晚期两种血清样品中沉淀抗体的量，如晚期有 明显增多，即可作出诊断。④间接血凝试验：应用间接血凝试验诊断鸡传染性支气管炎，方法如下： 以醛化鞣化的兔红细胞作载体，用IBV进行致敏，然后用明胶作稳定剂去掉其与非特异 性蛋白相结合的性能，研制出IB间接血凝试验抗原。用该抗原直接与待检血清作间接 血凝试验即可作出诊断。结果表明，本法对IB具有较高的敏感性和特异性，而且操作简便。 经与新城疫、马立克氏病及传染性喉气管炎等多种鸡病进行鉴别试验，表明有明显的特异性 。⑤其它：其它血清学试验如直接和间接补体结合试验以及血凝试验和血凝抑制试验也曾用于 鸡传染性支气管炎抗体的检测，但均未广泛应用。Muneer等(1988)报道用免疫酶斑点试验 检测抗IBV抗体，证明是1种经济、简便和灵敏的方法，可望成为本病早期诊断、疫病普查 和疫苗免疫测定的有用方法。
(3)RNA T1酶指纹图谱技术：鸡胚增殖病毒→纯化病毒→提取病毒RNA→RNA T1酶消化→耐受片段放射性标记→双向电泳→自显影得RNA T1酶指纹图谱。不同毒株 或同一毒株的变异株，其差异可准确地反映在图谱的产物位置上，此法在 荷兰(Kusters，1987)已有使用。(4)核酸探针：提取病毒RNA，反转录成cDNA，然后克隆到适当载体上，进行生物素标记制备 探针。亦可在进行PCR时掺入生物素标记物，获得的产物即为探针。用此 探针与气管拭子或病毒培养物进行杂交，可快速作出诊断定性。据kwon(1993a)报道，此法 对人工感染后1、3 、9、14天及电镜未能检出的鸡群均能确定感染，且快速、敏感。(5)PCR及其产物的RFLP：美、日(Kwon，1993b;Lin，1991)都已有这方面的研究报道， 先用PCR定性，再辅以RFLP鉴定血清型 。基本路线是：用野毒接种 鸡胚增殖病毒→快速提取RNA→通过对应IBV核酸序列的特异DNA引物做RTPCR获得 特异DNA片段，电泳检查，同时设标准阳性对照，如扩增片段与标准一致，即可定为IBV感染 。对PCR产物进行限制性内切酶消化，不同血清 型IBV的PCR产物可产生不同数目、不同长度的DNA片段，对 照标准毒株情况可鉴定到血清型。
上一篇：鸡传染性支气管炎病毒（一）
下一篇：猪传染性胃肠炎病毒
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
