诊断虽然东方型马脑炎和西方型马脑炎的临床症状相当特征，组织病理学上也有典型的病毒性脑炎变化，可提供一定的诊断依据,但是最后确诊必须靠病毒的分离、鉴定以及特异性血清学诊断。
(1)病毒的分离:分离病毒的材料包括马和其它发病动物的脑以及媒介昆虫组织,这些材料必须新鲜。由于在动物死后，病毒迅速消失，特别是在温暖季节，因此最为理想的方法是扑杀一个濒死期患畜，立即取出脑组织(大脑皮层和海马角各一块)，迅速冷藏，并尽快送至实验室。必要时可切取几块1cm3大小的上述脑组织，浸泡于50%中性甘油盐水中。实验室在收到标本后，立即加入05%的水解乳蛋白的Hanks液和青、链霉素，用匀浆机制成10%乳剂，离心沉淀后，取上清液作动物接种用。动物病毒血症期间(此时刚刚开始出现或者还未出现症状，但体温已经上升)的全血和血清中含有病毒，可作病毒分离之用。但因病毒血症出现在疾病早期，而且持续时间不长，因此必须尽早地在发病初期采血，分离血浆(以少量肝素抗凝，切勿用枸橼酸钠或草酸钠，以免脑内注射时引起惊厥)或血清。上述脑组织、血浆和血清等待检材料可以接种小鼠、豚鼠、鸡胚、新生雏鸡或仓鼠肾原代细胞、鸡胚或鸭胚原代细胞以及BHK21等细胞株。小鼠:取3周龄小鼠(乳鼠更为敏感),脑内接种002～003ml。皮下和脑内或脑内和腹腔同时接种(02～03ml)，效果更好。接种后每天观察1～2次直至第10天。小鼠常在3～5天发病，发病时被毛逆立，弓背，畏寒(钻入垫料中)，离群，抽搐，痉挛,最后死亡。豚鼠:取150～200克体重的幼年豚鼠，脑内接种01～02ml待检材料，通常于3～4天发病死亡。也可作皮下和腹腔注射，但病毒分离率不如脑内接种。新生雏鸡:刚出壳的雏鸡(又称湿雏)对EEEV和WEEV极为敏感，特别是在脑内接种时，可以用其分离极微量的病毒，是初次分离病毒的理想实验动物。鸡胚:可将1～2滴待检材料直接接种于9～10日龄鸡胚的绒毛尿囊膜上，也可取02ml注入尿囊腔内。鸡胚通常在15～24小时内死亡，胚体和绒毛尿囊膜含有大量病毒。组织培养细胞:以原代鸭胚或鸡胚细胞和仓鼠肾细胞最为敏感。可将待检材料稀释为10-2～10-5的不同浓度，接种单层细胞，置37℃吸附30～60分钟后，加入维持液，继续置37℃培养，出现细胞病变(约5天)即可收毒，供进一步传代或鉴定用。将原始病料作不同浓度稀释后分别接种细胞培养物，是为了避免可能发生的病毒干扰现象，因为,在应用细胞培养物增殖马脑炎病毒时，接种高浓度病毒有时反而不产生细胞病变。由于病毒对酸敏感，在细胞培养过程中，应定期加入碳酸氢钠液于细胞培养液中，使pH保持在76～78左右。
(2)病毒的鉴定:通常采用交叉中和试验。最简单的方法是用小鼠或豚鼠作动物中和试验，即用抗EEEV和抗WEEV的高免疫血清分别与100个小鼠或豚鼠LD50的待鉴定病毒混合，置37℃感作1小时后，接种小鼠或豚鼠，如果抗EEEV的高免血清保护动物(不死亡)，而抗WEEV的高免血清没有保护作用，则证明待鉴定病毒是EEEV，反之亦然。也可应用组织培养细胞进行测定。如上将100个TCID50的待鉴定病毒分别与EEEV和WEEV的标准血清混合并感作后，接种细胞培养物，根据细胞培养物是否出现细胞病变，判定病毒的种或型。蚀斑减数试验可用作毒种或毒型的鉴定，即在蚀斑技术的基础上进行病毒中和或交叉中和试验。具体方法是:先行测定待鉴定病毒在某种细胞培养物上的蚀斑形成能力，随后用10%脱脂乳盐水将病毒适当稀释，使其可在某种培养瓶内形成适当的蚀斑数，在90×50mm培养面积的长方形培养瓶中形成200个左右的蚀斑。另取抗EEEV和抗WEEV的标准免疫血清,用05%水解乳蛋白(以Hanks液配制)做成2×10-1和2×10-2的稀释液，分别与等量的上述病毒液混合，按蚀斑技术的方法接种单层细胞。由于免疫血清能够明显抑制相应病毒的蚀斑形成，故可根据两种标准血清的抑制程度(至少相差50%以上)，判定该病毒的种或型。必须指出，EEEV和WEEV以及它们与其它甲病毒成员在血清学试验以及免疫保护试验中可能发生的交叉反应，不仅决定于毒株本身，而且与免疫血清的制造方法、效价以及试验时的条件有关。因此，应当通过预备试验，规定标准的抗原和抗原制品，并且多做对比试验，建立标化的测定方法。切不可根据随便取来的免疫血清所做的一次测定结果，就下结论。亚型和抗原变异株的鉴定可以用针对E1或E2糖蛋白的单抗进行血凝抑制试验(HI),或者采用寡核苷酸指纹图技术加以鉴别。
(3)病毒抗原的检测:检测病毒抗原，是快速诊断的主要手段。可以应用固相反向补体结合试验，但需要濒死期或新死亡动物的脑组织作为被检材料。也可将濒死期或新死亡动物的脑组织作成抗原后用EEEV和WEEV的标准免疫血清进行常规补体结合试验，检测抗原。应用免疫电镜鉴定WEEV可获得理想结果。在025ml的感染尿囊液内加入等量高免鸡血清(最后浓度1∶25)，37℃感作30分钟，负染后检查可见团聚在一起的病毒粒子。Pelegrino等(1993)建立了双抗体ELISA和间接免疫荧光法，用于快速检测EEEV。实验表明这两种方法检测EEEV与中和试验相比，符合率为100%。前者可在病毒接种细胞6～8小时检测出病毒抗原。最近，一些研究工作者建立了快速、敏感和特异的分子诊断方法,用于检测EEEV、WEEV和VEEV以及其它甲病毒。建立的RTPCR法可以敏感而特异地检测蚊和鸟类组织器官中的EEEV或WEEV，从而监测病毒的活动，以预报何时在何处实施对蚊的控制，以减少人和动物感染的可能性。该方法既可检测出单只感染的蚊，也可用于人和动物的早期诊断。Vinskaia等(1992)根据甲病毒基因组3端的序列特点，设计并制备了病毒种群特异的DNA探针，建立了核酸杂交检测方法，可以特异地检测和鉴定EEEV、WEEV或VEEV等甲病毒的RNA。该方法敏感性高，可检测出1ng的病毒RNA。
(4)特异性抗体的检测:血凝抑制抗体与中和抗体的出现，一般可在发病后检出，并可持续数月之久。补体结合抗体出现较晚，须在发病10天以后才能检出，持续时间也较短，约几个星期。抗体检测主要用于流行病学调查。对于临床病例的诊断，则应采取急性期和恢复期的双份血清，比较两者的抗体效价，以增高4倍以上者具有诊断意义。目前已建立了两种检测EEEVIgG和IgM抗体的方法，一种是抗体捕捉ELISA法，它可做为血凝抑制试验(HI)和中和试验的补充，用于马群中EEEV感染的诊断，该方法可以鉴别是最近感染还是先前的免疫接种。在急性前期的病例中，IgM和IgG阳性(ELISA检测)、中和抗体阴性，但HI抗体阳性，在急性期的病例中，IgM和HI抗体阳性，但IgG和中和抗体阴性，在过渡期的病例中，这4种抗均为阳性。在ELISA中IgM抗体是病毒特异的，它不与WEEV和VEEV发生交叉反应。另一种是酶免疫测定法(EnzymeImmunoassay,EIA),该方法可用于检测鸡感染EEEV后所产生的抗体,在鸡感染病毒后2～4天即可检测出IgM和IgG的产生，与蚀斑减数中和试验和HI试验检出抗体的时间一致。鸡感染病毒30天后，就测不出IgM,所以该方法可以通过鉴别鸡群的感染时间来监视病毒在鸡群中的流行状况。
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