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马动脉炎病毒



录入时间:2009-7-7 9:57:46 来源:青岛海博

  马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)马传染性动脉炎(EA)的临床特征是病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,出现粘液脓性鼻炎,外生殖道水肿,妊马流产。本病在厩舍内迅速传播,公马也可接触感染。1957年,美国Doll等人从俄亥俄州发生的以母马流产为特征的病马中分离出病毒,称为马动脉炎病毒,简称EAV。后来证明这种病毒引起的疾病,也就是在历史上德国称为,“Rotlaufseuche”、英国称为“流行性蜂窝织炎红眼综合症”或“伤寒热”的疾病。Doll分离的“Bucyrus”株病毒被认为是EAV的原型病毒。此后,美国的McCollum用马肾细胞在肯塔基地区分离出病毒。经鉴定,证明该病毒与Bucyrus原型病毒株一致。欧洲首次在瑞士,后来在维也纳也都分离获得病毒。印度在1965年报道了EAV的血清学证据。过去,EA在临床上常常与马流感和马鼻肺炎(病毒性流产)混淆。马是这种病唯一的易感动物,自然感染主要发生在种马场内。
  1.形态和理化学特性EAV粒子呈球形,直径60nm,沉降系数为224S±8S,在蔗糖和CsCl密度梯度中的浮密度分别为113~117g/cm3和117~120g/cm3。核衣壳直径约35nm,沉降系数为158S,外披一层12~15nm厚的囊膜,囊膜表面有12~15nm长的环状纤突。病毒基因组为单拷贝线状正链RNA,长约13kb,分子量41~43×106kDa,沉降系数为48S,3端有Poly(A)尾。基因组RNA具有感染性。病毒粒子含4种结构蛋白:核心蛋白N,分子量约14kDa;非糖基化的膜蛋白M,分子量约16kDa;小糖蛋白Gs,分子量约25kDa,以二硫键连接的同二聚体形式存在于病毒粒子上;大糖蛋白GL,分子量30~42kDa。在病毒粒子上GL不以单体形式存在,而是与M形成异二聚体。Gs是病毒的次要蛋白,仅占1~2%,但在感染细胞中含量很高,N、M和GL在病毒粒子上含量基本相当,分子比依次为3∶2∶3。
 
  2.分子生物学EAV基因组全序列已被测定,有7个开放阅读框架(ORF1~7)。亚基因组的引导序列长207nt,来源于基因组5端非编码区。目前尚不清楚5端是否有帽结构。ORF1又分为ORF1a和ORF1b,占整个基因组5端的3/4,ORF1a和ORF1b有19nt长的重叠区。ORF1a编码复制酶多聚蛋白,分子量约187kDa,该多聚蛋白被自身具有的蛋白酶活性区进一步裂解成6种非结构蛋白,命名为nsp1至nsp6,分子量分别为29,61,22,31,4和3kDa。nsp1中有2个木瓜酶样的半胱氨酸蛋白酶活性区(PCP),称PCPα和PCPβ。PCPα无活性,不能将nsp1切成nsp1α和nsp1β,只有PCPβ有蛋白酶活性,专门切开nsp1/2间的酶切点,从多聚蛋白上释放出来nsp1。而LDV和PRRSV的PCPα和β均有酶切活性,所以这两种病毒均可产生nsp1α和1β。其它nsp是由nsp4中的丝氨酸蛋白酶活性区和另一种未知的蛋白酶加工产生的。比较不同EAV毒株序列,发现M和N氨基酸序列是保守的,GLN端亲水区后1/2段氨基酸序列为非保守区,前1/2段氨基酸序列以及转膜区和C端氨基酸序列为保守区。GL由ORF5编码,其多肽链上有1~2个糖基化位点,由于糖基化程度不同所以有较大的分子量范围。它是EAV最主要的保护性抗原,其55~98位氨基酸区域具有较强的免疫原性,它含有一个中和抗原表位,此抗原表位可能最充分地暴露于病毒粒子表面,对刺激机体的免疫反应具有重要作用。单抗研究的结果表明,GL上有多个抗原表位,其某些氨基酸的改变可导致病毒中和特性的改变,从而产生中和性单抗逃脱变异株,如99~104之间氨基酸序列的突变以及96和113位氨基酸的改变都可导致这种变异株产生,这些区域均位于GLN端的非保守区内。感染细胞中GL未糖基化前为一20kDa的蛋白质,在内质网糖基化后,分子量变为30~42kDa。细胞中所有GL分子都通过二硫键与M连接形成异二聚体,而不以单体形式存在,M除与GL形成异二聚体外,自身还形成同二聚体,但成熟病毒粒子上并没有M同二聚体,此外细胞中还有一部分为单体形式的M蛋白。Gs作为病毒粒子上的少数成份,却在细胞中有大量表达,含量与M蛋白相当,它有一个N糖基化位点。感染细胞中的Gs有4种单体构型和1种二硫键连接的同二聚体结构,Gs单体选择性地蓄留于内质网,它们对内切糖苷酶敏感。而Gs同二聚体对该酶有抵抗力,在病毒成熟过程中,通过高尔基体时被唾液酸化,此后包装入病毒粒子。
 
  3.遗传变异与抗原性EAV迄今只有一个血清型。不同地理来源的毒株在血清学上与1953年分离获得的Bucyrus原型毒株基本一致。但近年研究发现EAV存在不同的抗原变异株。EAV的抗原性和免疫原性主要是由病毒粒子表面的大糖蛋白GL决定的,它有最主要的中和抗原决定簇,有许多抗原表位。GL分子上某些氨基酸发生突变可导致抗原变异,产生免疫逃脱变异毒株。通过寡核苷酸指纹图比较,发现不同地理来源的毒株之间在寡核苷酸同源性上有明显差别,有的毒株间寡核苷酸同源性不到60%。Chirnside等(1994)比较了不同毒株M和N蛋白的基因序列及衍生的氨基酸序列,通过系统树分析发现,EAV可能存在3个变异群(variant):以Bucyrus株为代表的美国变异群;以维也纳株为代表的奥地利变异群和以Bibuna株为代表的瑞士变异群。
 
  4.培养与增殖病毒可在多种培养细胞中生长并产生细胞病变(CPE)。常用的传代细胞有马肾细胞、兔肾细胞、猴肾细胞LLCMK2、马皮肤细胞E.dermNBL6以及BHK21和Vero细胞。在BHK21及Vero细胞中可以产生蚀斑。可以利用蚀斑减数试验鉴定病毒及抗体。早期试验用LLCMK2猴肾细胞传代时,虽然也可见到相应的CPE,但CPE出现较迟,至接种后100小时才能在细胞浆中出现特殊的膜样结构,说明细胞已经发生变化,但却看不到病毒粒子。而E.dermNBL6则非常适合于EAV的增殖,病毒复制快,产量也高。Bucyrus原型毒株在连续通过马肾细胞传代而减弱其对马的致病力后,可用于免疫接种。EAV虽然可在上述各种细胞中增殖,但直接用病马组织分离病毒时,仅马源细胞产生CPE,在已适应马源细胞以后,即可继续在其它动物源的细胞中复制。电镜检查证明,病毒的形态发生与病毒的生长密切相关。细胞在感染后9~12小时,出现核蛋白体聚积以及许多异常现象,例如细胞浆内出现特殊的膜样结构,但不能看到病毒粒子。到18小时,即可初次看到病毒粒子。在感染后的24、30、34直到43小时,随着病毒滴度的增高,成熟病毒粒子的数目也增加。并可看到这些病毒粒子是从胞浆的空泡中芽生出来,聚积在空泡内和散在于细胞间的空隙中。细胞浆此时已完全损坏,细胞核内没有病毒复制的迹象。胞浆空泡内病毒粒子的平均直径是43±2nm。将病毒粒子从中线切开时,可测得其核衣壳的平均直径为35±2nm。

 

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