流行性乙型脑炎病毒(三)
7.免疫乙脑病毒产生坚强的持久免疫力，迄今没有见到临床病例在痊愈后第二 次感染发病 的报道。且如上述，乙脑病毒的抗原变异不显著，尚未发现在免疫保护力方面明显不同 的型或亚型，这就为流行性乙型脑炎的特异性预防提供了良好的基础。目前应用的乙脑 疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种。灭活疫苗的制造方法简单，易于保存，而且安全，但 因注射剂量较大，而且经常需要重复注射，国内目前应用的动物乙脑疫苗以弱毒疫苗为 主，但人用乙脑疫苗主要是灭活疫苗。
(1) 灭活疫苗：1943年，美国Sabin创制鼠脑灭活疫苗。 我国和日本也生产过大批 鼠脑灭活疫苗，并对人群进行大规模的免疫注射。由于疫苗中的鼠脑组织经常引起过敏 反应，日本于1966年研究成功酒精和鱼精蛋白纯化疫苗。美国于1966年创制仓鼠肾组织 培养灭活疫苗,免疫效果较好，而且适于大量生产，故已几乎全部取代了鼠脑灭活疫苗。 只在不具备组织培养条件的少数地区，继续沿用鼠脑灭活疫苗作动物的预防注射。
① 鼠脑灭活疫苗：采用免疫原性良好的强毒株，脑内通过8～12g小鼠， 使其最小 致死量提高至10-7/003ml(脑内)以上，作为种毒。制苗时，取种毒脑内接种小鼠 ，每只003ml。逐日观察，一般于接种后第3～4天出现症状，挑选症状明显和濒死的小鼠 ，断颈或心脏放血后无菌采脑，置于内盛玻珠的厚壁玻瓶或于电动组织捣碎器内充分乳化 ，并补加pH78～80的磷酸盐缓冲盐水，作成10%悬液。再置2 000r/min的离心机内 离心沉淀20分钟，吸取上层液，加入10%福尔马林，使其最后浓度为02%。置4℃冰箱内， 每天充分振荡一次，灭活21天。再用pH78～80的磷酸盐缓冲盐水稀释1倍， 使鼠脑的 最后浓度为5%，福尔马林的最后浓度为01%。作者所在的实验室曾用这个方法制造乙脑 灭活疫苗,在用小鼠作效力测定时免疫指数(保护指数)高达20万以上。这种疫苗用于 马骡时，每次皮下注射5ml，间隔7～10天后再作第2次注射。 一般可使接种马骡安全渡 过一个乙脑流行期。据几个地区的应用结果来看，注射鼠脑灭活疫苗后可将发病率降低 至1/3～1/5。制造酒精鱼精蛋白纯化疫苗时，先将发病鼠脑作成20%悬液，以3 500r/min的速度 于4℃离心沉淀30分钟，弃沉淀，吸取上层液，加入等量4℃的40%酒精，置10～15℃3小时 ，再以3 500r/min的速度离心沉淀30分钟，弃上层液，取沉淀物，加入4℃ PBS， 作成40 %悬液，再以3 500r/min的速度于4℃离心沉淀30分钟，弃沉淀，吸取上层液，加入等量 4℃ PBS，并按每ml 2～3mg的量加入硫酸鱼精蛋白，置4℃感作30分钟后，以3 500r/mi n的速度于4℃离心沉淀30分钟，弃沉淀物，吸取上层液，加入福尔马林和硫柳汞，使其 最后浓度为01%和001%。再作适当稀释，并加入005%吐温80即成。
② 鸡胚灭活疫苗：先使种毒通过鸡胚几代，待其完全适应于鸡胚内增殖后应用。 将 鸡胚适应毒作1∶100～1∶1 000稀释后，接种于8日龄鸡胚的卵黄囊内，于35～36℃温箱中 继续孵育64～68小时后收获胚体，去头及爪，加入pH78～80的磷酸盐缓冲盐水，于组 织捣碎器内作成20%悬液，以2 000r/min的速度于4℃灭活处理21天，经无菌、安全和效 力检验后应用。马骡每次皮下注射10ml，间隔7～10天后再作第2次注射。由于鸡胚苗的 免疫效果较差，用量大，保存期短，多次注射后曾见少数马匹发生过敏反应，目前已少用.
③ 仓鼠肾组织培养灭活疫苗：接种强毒于仓鼠肾组织培养细胞内， 约于接毒后30～40 小时，在出现“++”的细胞病变时收获，加入01%～02%福尔马林作灭活处理，即为灭 活疫苗。为了提高疫苗产量，生物制品单位目前通用转瓶培养法，即在10 000～15 000 ml的大转瓶内，接常规方法培养仓鼠肾细胞，以内含5%犊牛血清的02%乳白蛋白水解物 作为营养液，转瓶培养。待其长成单层后，以Earle液冲洗多次， 除去残留的血清蛋 白，随后换入内含007%半胱氨酸和01%人白蛋白的Earle液作维持液。维持液中含有 10-5浓度的强毒鼠脑。每瓶加入量为3 000ml。37℃培养28小时，镜检发现开始有细胞 病 变时即可收毒——吸取上层液。毒力效价一般可达10-6个小鼠MLD。加入005%福尔 马林和0005%硫柳汞，置22℃灭活8天即成。在残留有细胞的大转瓶内，再行加入3 000ml 维持液，继续培养17～20小时，有时还可获得10-5～10-6效价的病毒液。
(2) 弱毒疫苗：我国病毒学工作者在乙脑病毒的减毒和弱毒株的培育方面，做了大量 工作，并已取得可喜成果。先后育成许多弱毒疫苗株，其中某些株已经做过大量人群或 动物的免疫试验。美国和日本也曾育成几个弱毒株，例如美国应用仓鼠肾组织培养细胞 进行继代减毒，获得OCT541株，再经鸡胚细胞和鸡脑细胞传代，育成高度减毒株。 日 本也用仓鼠肾细胞传代的方法获得几个弱毒株。
① 53株：系我国乙脑强毒SA14株经驯化筛选后获得的弱毒疫苗株。SA14株 在连续通 过仓鼠肾原代细胞20代后，毒力发生显著变化，其对小鼠的脑内毒力已由10-5～10 -6下降至10-1～1025/003ml。经蚀斑纯化后育成1217号蚀斑株，继续 传代减 毒、 纯 化，又选出1株蚀斑毒，即97株,再经传代筛选，育成53株。用此株给3周龄小鼠作皮 下注射，病毒不能入脑，但对25周龄以下的小鼠，还有一定的入脑能力。 皮下或脑 内注射1～3日龄乳鼠，均有致病力。脑内及皮下注射时的致死毒力(LD50)分别为3 0 对数以下和20对数以下。曾经试用于40多万儿童的接种试验，证明安全， 并有较好的免 疫效果，人群保护率达80～90%，抗体阳转率为85～91%。将53株或97株试用于马匹和 猪的免疫接种，也获较好效果。目前通用的是其仓鼠肾组织培养弱毒疫苗。 由于53株和97株在小鼠脑内连续传3～5代后，残余毒力并不明显回升。某些地 区试用此株接种(脑内)乳鼠，待其发病后，采脑作成10%悬液， 直接供马骡或猪的 现场应用，收到较好效果。
② 28株：系将上述1217株经紫外线进一步减毒，再经乳鼠皮下传代，提高其皮 下增殖力和免疫原性而育成的弱毒疫苗株。此株在给乳鼠作脑内注射时，死亡率为75%， 皮下注射时引起50%的死亡率。3周龄小鼠在脑内注射时基本上不死亡，皮下注射后病 毒不能入脑。经乳鼠脑内连续传代，毒力回升不明显。给小鼠作一次皮下免疫注射， 保护力可达70对数以上。大规模的马群免疫试验(13万余匹)证明安全。免疫后1个月， 中和抗体的阳转率达85%左右。流行病学调查证明，疫苗注射组的发病率为23/10万，而 未注射对照组的发病率为1721/10万，保护率为867%。目前通用仓鼠肾细胞培养疫苗。 试用28株接种小鼠，待其发病后采脑制苗，注射马骡和猪，也取得良好的免疫效果。 曾用鼠脑和仓鼠肾培养的28株给4万多匹马进行免疫注射， 仅极少数发生轻度局部 肿胀、低烧和食欲减退，未见其它不良反应。 敖坚等应用另一弱毒蚀斑株——142株在BHK21细胞上制造弱毒疫苗。用 以给妊娠母猪进行免疫注射，未见不良反应。接种后的中和抗体阳转率为80%～100%，死 产率显著下降。 在上述弱毒疫苗株的基础上，又曾育成一些新的弱毒株，例如将53株通过鸡胚、 仓鼠肾细胞交替传代3次， 再在鸡胚细胞上挑斑( 蚀斑)， 育成所谓的鸡53株等等。 由于液体活疫苗在4℃的有效期仅2～3个月， 而冻干保存时又易在干燥过程中使疫苗效价下 降，因此必须积极研究弱毒疫苗的保存方法，以利推广应用。 幼畜可由初乳获得被动免疫——母源抗体。具有被动免疫的幼畜，在用弱毒疫苗接种 后不易产生主动免疫。为保证有效免疫力的产生，活疫苗接种应在幼驹出生后2～4个月进 行，幼猪也应在出生后2个月以上开始接种。 日本曾用井上等育成的减毒M株于猪的预防接种。
(3) 基因工程疫苗： Konishi等在1994年以禽痘病毒作为载体分别表达了JEV的preM、E和NS1基因以及 pre M和E基因；重组病毒免疫小鼠，能抵抗致死剂量JEV的攻击。 Konishi等于1992年在一 个高度致弱的痘苗病毒株NYVAC表达了JEV的preM、E和NS1基因， 以108PFU的重组病毒 免疫猪，7天后血清中出现JEV中和抗体及血凝抑制抗体，28天后注射第二个剂量的重组病毒 , 血清中和抗体效价增高。在用2×105PFU JEV攻击后， 已接种重组病毒的猪血清中JEV水 平显著降低。活载体疫苗与常规疫苗相比,有着一定的优势，有望代替常规疫苗的应用。
上一篇：流行性乙型脑炎病毒(二)
下一篇：流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
海博微信公众号
海博天猫旗舰店
