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流行性乙型脑炎病毒免疫



录入时间:2009-7-8 13:37:09 来源:青岛海博

流行性乙型脑炎病毒(三)
 7.免疫乙脑病毒产生坚强的持久免疫力,迄今没有见到临床病例在痊愈后第二 次感染发病 的报道。且如上述,乙脑病毒的抗原变异不显著,尚未发现在免疫保护力方面明显不同 的型或亚型,这就为流行性乙型脑炎的特异性预防提供了良好的基础。目前应用的乙脑 疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种。灭活疫苗的制造方法简单,易于保存,而且安全,但 因注射剂量较大,而且经常需要重复注射,国内目前应用的动物乙脑疫苗以弱毒疫苗为 主,但人用乙脑疫苗主要是灭活疫苗。 
 (1) 灭活疫苗:1943年,美国Sabin创制鼠脑灭活疫苗。 我国和日本也生产过大批 鼠脑灭活疫苗,并对人群进行大规模的免疫注射。由于疫苗中的鼠脑组织经常引起过敏 反应,日本于1966年研究成功酒精和鱼精蛋白纯化疫苗。美国于1966年创制仓鼠肾组织 培养灭活疫苗,免疫效果较好,而且适于大量生产,故已几乎全部取代了鼠脑灭活疫苗。 只在不具备组织培养条件的少数地区,继续沿用鼠脑灭活疫苗作动物的预防注射。 
 ① 鼠脑灭活疫苗:采用免疫原性良好的强毒株,脑内通过8~12g小鼠, 使其最小 致死量提高至10-7/003ml(脑内)以上,作为种毒。制苗时,取种毒脑内接种小鼠 ,每只003ml。逐日观察,一般于接种后第3~4天出现症状,挑选症状明显和濒死的小鼠 ,断颈或心脏放血后无菌采脑,置于内盛玻珠的厚壁玻瓶或于电动组织捣碎器内充分乳化 ,并补加pH78~80的磷酸盐缓冲盐水,作成10%悬液。再置2 000r/min的离心机内 离心沉淀20分钟,吸取上层液,加入10%福尔马林,使其最后浓度为02%。置4℃冰箱内, 每天充分振荡一次,灭活21天。再用pH78~80的磷酸盐缓冲盐水稀释1倍, 使鼠脑的 最后浓度为5%,福尔马林的最后浓度为01%。作者所在的实验室曾用这个方法制造乙脑 灭活疫苗,在用小鼠作效力测定时免疫指数(保护指数)高达20万以上。这种疫苗用于 马骡时,每次皮下注射5ml,间隔7~10天后再作第2次注射。 一般可使接种马骡安全渡 过一个乙脑流行期。据几个地区的应用结果来看,注射鼠脑灭活疫苗后可将发病率降低 至1/3~1/5。制造酒精鱼精蛋白纯化疫苗时,先将发病鼠脑作成20%悬液,以3 500r/min的速度 于4℃离心沉淀30分钟,弃沉淀,吸取上层液,加入等量4℃的40%酒精,置10~15℃3小时 ,再以3  500r/min的速度离心沉淀30分钟,弃上层液,取沉淀物,加入4℃ PBS, 作成40 %悬液,再以3 500r/min的速度于4℃离心沉淀30分钟,弃沉淀,吸取上层液,加入等量 4℃ PBS,并按每ml 2~3mg的量加入硫酸鱼精蛋白,置4℃感作30分钟后,以3 500r/mi n的速度于4℃离心沉淀30分钟,弃沉淀物,吸取上层液,加入福尔马林和硫柳汞,使其 最后浓度为01%和001%。再作适当稀释,并加入005%吐温80即成。 
 ② 鸡胚灭活疫苗:先使种毒通过鸡胚几代,待其完全适应于鸡胚内增殖后应用。 将 鸡胚适应毒作1∶100~1∶1 000稀释后,接种于8日龄鸡胚的卵黄囊内,于35~36℃温箱中 继续孵育64~68小时后收获胚体,去头及爪,加入pH78~80的磷酸盐缓冲盐水,于组 织捣碎器内作成20%悬液,以2 000r/min的速度于4℃灭活处理21天,经无菌、安全和效 力检验后应用。马骡每次皮下注射10ml,间隔7~10天后再作第2次注射。由于鸡胚苗的 免疫效果较差,用量大,保存期短,多次注射后曾见少数马匹发生过敏反应,目前已少用.
③ 仓鼠肾组织培养灭活疫苗:接种强毒于仓鼠肾组织培养细胞内, 约于接毒后30~40 小时,在出现“++”的细胞病变时收获,加入01%~02%福尔马林作灭活处理,即为灭 活疫苗。为了提高疫苗产量,生物制品单位目前通用转瓶培养法,即在10 000~15 000 ml的大转瓶内,接常规方法培养仓鼠肾细胞,以内含5%犊牛血清的02%乳白蛋白水解物 作为营养液,转瓶培养。待其长成单层后,以Earle液冲洗多次, 除去残留的血清蛋 白,随后换入内含007%半胱氨酸和01%人白蛋白的Earle液作维持液。维持液中含有 10-5浓度的强毒鼠脑。每瓶加入量为3 000ml。37℃培养28小时,镜检发现开始有细胞 病 变时即可收毒——吸取上层液。毒力效价一般可达10-6个小鼠MLD。加入005%福尔 马林和0005%硫柳汞,置22℃灭活8天即成。在残留有细胞的大转瓶内,再行加入3 000ml 维持液,继续培养17~20小时,有时还可获得10-5~10-6效价的病毒液。  
(2) 弱毒疫苗:我国病毒学工作者在乙脑病毒的减毒和弱毒株的培育方面,做了大量 工作,并已取得可喜成果。先后育成许多弱毒疫苗株,其中某些株已经做过大量人群或 动物的免疫试验。美国和日本也曾育成几个弱毒株,例如美国应用仓鼠肾组织培养细胞 进行继代减毒,获得OCT541株,再经鸡胚细胞和鸡脑细胞传代,育成高度减毒株。 日 本也用仓鼠肾细胞传代的方法获得几个弱毒株。
① 53株:系我国乙脑强毒SA14株经驯化筛选后获得的弱毒疫苗株。SA14株 在连续通 过仓鼠肾原代细胞20代后,毒力发生显著变化,其对小鼠的脑内毒力已由10-5~10 -6下降至10-1~1025/003ml。经蚀斑纯化后育成1217号蚀斑株,继续 传代减 毒、 纯 化,又选出1株蚀斑毒,即97株,再经传代筛选,育成53株。用此株给3周龄小鼠作皮 下注射,病毒不能入脑,但对25周龄以下的小鼠,还有一定的入脑能力。 皮下或脑 内注射1~3日龄乳鼠,均有致病力。脑内及皮下注射时的致死毒力(LD50)分别为3 0 对数以下和20对数以下。曾经试用于40多万儿童的接种试验,证明安全, 并有较好的免 疫效果,人群保护率达80~90%,抗体阳转率为85~91%。将53株或97株试用于马匹和 猪的免疫接种,也获较好效果。目前通用的是其仓鼠肾组织培养弱毒疫苗。  由于53株和97株在小鼠脑内连续传3~5代后,残余毒力并不明显回升。某些地 区试用此株接种(脑内)乳鼠,待其发病后,采脑作成10%悬液, 直接供马骡或猪的 现场应用,收到较好效果。
  ② 28株:系将上述1217株经紫外线进一步减毒,再经乳鼠皮下传代,提高其皮 下增殖力和免疫原性而育成的弱毒疫苗株。此株在给乳鼠作脑内注射时,死亡率为75%,  皮下注射时引起50%的死亡率。3周龄小鼠在脑内注射时基本上不死亡,皮下注射后病 毒不能入脑。经乳鼠脑内连续传代,毒力回升不明显。给小鼠作一次皮下免疫注射, 保护力可达70对数以上。大规模的马群免疫试验(13万余匹)证明安全。免疫后1个月, 中和抗体的阳转率达85%左右。流行病学调查证明,疫苗注射组的发病率为23/10万,而 未注射对照组的发病率为1721/10万,保护率为867%。目前通用仓鼠肾细胞培养疫苗。 试用28株接种小鼠,待其发病后采脑制苗,注射马骡和猪,也取得良好的免疫效果。  曾用鼠脑和仓鼠肾培养的28株给4万多匹马进行免疫注射, 仅极少数发生轻度局部 肿胀、低烧和食欲减退,未见其它不良反应。  敖坚等应用另一弱毒蚀斑株——142株在BHK21细胞上制造弱毒疫苗。用 以给妊娠母猪进行免疫注射,未见不良反应。接种后的中和抗体阳转率为80%~100%,死 产率显著下降。  在上述弱毒疫苗株的基础上,又曾育成一些新的弱毒株,例如将53株通过鸡胚、  仓鼠肾细胞交替传代3次, 再在鸡胚细胞上挑斑( 蚀斑), 育成所谓的鸡53株等等。  由于液体活疫苗在4℃的有效期仅2~3个月, 而冻干保存时又易在干燥过程中使疫苗效价下 降,因此必须积极研究弱毒疫苗的保存方法,以利推广应用。  幼畜可由初乳获得被动免疫——母源抗体。具有被动免疫的幼畜,在用弱毒疫苗接种 后不易产生主动免疫。为保证有效免疫力的产生,活疫苗接种应在幼驹出生后2~4个月进 行,幼猪也应在出生后2个月以上开始接种。  日本曾用井上等育成的减毒M株于猪的预防接种。
  (3) 基因工程疫苗:  Konishi等在1994年以禽痘病毒作为载体分别表达了JEV的preM、E和NS1基因以及 pre M和E基因;重组病毒免疫小鼠,能抵抗致死剂量JEV的攻击。 Konishi等于1992年在一 个高度致弱的痘苗病毒株NYVAC表达了JEV的preM、E和NS1基因, 以108PFU的重组病毒 免疫猪,7天后血清中出现JEV中和抗体及血凝抑制抗体,28天后注射第二个剂量的重组病毒 , 血清中和抗体效价增高。在用2×105PFU JEV攻击后, 已接种重组病毒的猪血清中JEV水 平显著降低。活载体疫苗与常规疫苗相比,有着一定的优势,有望代替常规疫苗的应用。

 

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