流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
根据乙型脑炎明显的季节性和地区性及其临床特征，例如高热和狂暴或 沉郁等神 经症状，流行期中不难作出诊断。但是必须与其它的病毒性、细菌性和中毒性脑炎相鉴别。 由于母猪可能发生流产，公猪可能发生睾丸炎，还需注意与布氏杆菌病、细小病毒病以及生 殖和呼吸道综合症等鉴别。为了确诊，必须进行病毒分离和血清学试验等特异性诊断。
(1) 病毒的分离和鉴定：在动物发热初期，可采血液或血清分离病毒。动物死后， 应尽快(夏天不得超过2～3小时)采取脑组织分离病毒。各项操作以 及病料的运送，必须遵守“冷藏”和“快速”两个原则。根据作者等的经验，如将乳 鼠带到现场接种，可以明显提高病毒分离率。 乳鼠是应用最多的实验动物，也是多年来实践证明比较有效的病毒分离动物。 应用脑内皮下同时接种法或在脑内接种的同时，再较大量地作腹腔接种，例如02～0 5ml，常可提高病毒分离率。乳鼠发病时，离群、拒食、抽筋、消瘦， 此时即可采脑作 进一步传代或鉴定。但需注意，发病乳鼠常被母鼠吃掉，故应及时将母鼠取走。也可将上述材料接种于7～9日龄的鸡胚卵黄囊内，2～3天后收获胚体，再作乳鼠接 种。 近年来常用仓鼠肾原代细胞分离乙脑病毒，即在已经长成单层的仓鼠肾细胞内 加入该培养瓶(管)原营养液量1/5～1/10的接种材料，吸附30～60分钟后，加入维持液， 继续置37℃，每天观察1次，共7天，如发现“＋＋”的细胞病变，即可收获，供传代或鉴 定用。仓鼠肾BHK21细胞系也可被用于分离病毒，接种病料后观察1周后如无CPE出现,可作盲传。 即使被检材料中含有病毒，但在初代接种小鼠或细胞培养物后，往往不见发病或 不出现细胞病变，这是野外毒株尚未适应实验动物或细胞培养物的缘故。 因此第1代接 种呈阴性结果时，应继续盲传2～3代，也就是经一定时间(7～10天) 而尚未发现动物发 病或细胞出现病变时，可按常法扑杀几个动物采脑，或选取几瓶细胞培养物作冻融处理， 再作下一代动物或细胞培养物的传代接种。 欲由蚊体分离病毒时，用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室内饲养2～3天，待胃血 消化，抗体消失,这样可以提高病毒分离率。分离时用氯仿将蚊熏死，鉴定分类，并以 25、50或100只为1批，装入灭菌的小瓶或试管中。随后加入2～3ml25%酒精生理盐水， 充分摇洗5～10分钟，倒掉酒精液，再用灭菌生理盐水或Hanks液洗2～3次后，移入玻璃 研磨器内，加入1～2ml05%乳白蛋白水解物或其它稀释液，磨细后移入离心管，以3 00 0r/min转的速度离心沉淀20分钟，吸取上清液，如上加入青、链霉素，置4℃感作1小时 后接种动物或细胞。细胞营养液内应加两性霉素，以免霉菌生长。 Hsu等在台湾南部 收集猪场的蚊，自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000只，分为1 650批，做成乳剂后 分别接种乳鼠和库蚊细胞培养物。在库蚊细胞培养物中分离到68株乙脑病毒，由乳 鼠脑分离到48株病毒，似乎说明库蚊细胞培养物比乳鼠更适于由蚊体分离乙脑病毒。新分离病毒的初步鉴定按一般方法进行，请参阅本书第十四章。随后再用乙脑标准 毒株和标准免疫血清与新分离病毒进行交叉补体结合试验、交叉中和试验、交叉血凝抑 制试验。也可应用小鼠进行交叉保护试验，即用新分离毒株和标准乙脑毒株分别制备 福尔马林灭活疫苗，给3周龄小鼠皮下接种01～02ml，共2次，间隔7天， 另留部 分小鼠不免疫作为对照。于第2次注射后两周，用不同稀释度的标准乙脑毒株攻击：采用腹 腔攻击、脑内刺激法，即在腹腔注射病毒的同时，给每只小鼠脑内注射003ml 生理盐水或肉汤。观察3周，记录各组小鼠的死亡和保护数。如为同种病毒， 则其抵 抗标准乙脑毒株的攻击量可比对照组高100～1 000倍， 并与以标准乙脑毒株免疫的小鼠 组的保护率相近。 检出病畜体内的病毒抗原，是快速诊断的需要，也是国内外正在探索和深入研究的 一个课题。作者等应用固相和液相补体结合试验、免疫粘附试验、反向间接血凝试验、 荧光抗体技术、免疫酶技术、125I放射免疫测定以及反转录多聚酶链RTPCR反应 等方法检测乙脑感染小鼠和自 然感染病马脑内的病毒抗原，都有较高的特异性和检出率。
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