猪瘟病毒诊断
为了消灭猪瘟，需要快速而确实的诊断技术。流行病学、症状学和病理解剖学等方 面的资料，具有重要的参考价值，但确诊必须采取病料，进行病毒的分离鉴定或作抗体 测定。 疫情调查时，除需注意流行情况,还应了解是否已经进行免疫接种， 所用疫苗有无 残余毒力?非典型猪瘟在成年猪中大多表现为轻症疾病，或者完全没有症状， 而只仔猪 和乳猪则发病。但是初生仔猪没有特征性的病理变化，难以根据病变特征进行诊断。 近二十多年来，世界各国对猪瘟的实验诊断进行了大量研究，现将已被实际采用的 几种方法介绍如下：
(1) 动物接种：检测猪瘟病毒的最敏感方法，就是应用易感的幼龄猪( 20～40斤体 重)进行接种试验。取病猪或新鲜猪尸的血液或组织乳剂肌肉接种1～2头幼猪。 试验幼 猪应事先进行中和试验，排除猪瘟和病毒性腹泻粘膜病的感染。如果幼猪在接种后6～ 7天停食或体温升高，则即采血分离病毒。幼猪发病死亡后，立即采取扁桃体、 脾脏和 颔下淋巴结作病毒分离。如果幼猪在接种后21天不发病或者发病后恢复，则采血测定血 清的中和效价，并用强毒进行攻毒试验。由血液或组织中分离获得猪瘟病毒，或者被接 种幼猪产生中和抗体，对强毒攻击呈现免疫性，即可判为阳性。相反，幼猪不发病，不 产生中和抗体，则应考虑其它病原体的可能性。由于普遍存在低毒力的猪瘟病毒株，所 以即使被接种幼猪不呈现典型猪瘟症状，也应进行血液中的病毒分离试验。 也可应用抗猪瘟高免血清进行接种保护试验。将待检病料皮下注射2头幼猪，其中1 头注射高免血清(每公斤体重1ml)，如果被检病料中含有猪瘟病毒， 则未注射血清的 幼猪发病，而被动保护的幼猪不发病。如果未注射血清的幼猪也不发病，则在接种后21 天将这二头幼猪同时接种强毒进行攻击。 如果待检病料中含有致病性细菌，则注射高免血清和未注射高免血清的幼猪都将发 病。当然，如果抗猪瘟高免血清中同时含有抗菌抗体，则就易于发生误诊。 增加试验猪数，当然可以提高试验的精确性。但是必须相应增加隔离设施，工作量和费 用当然也将增多。 中国兽药监察所建立了一个应用家兔代替猪诊断猪瘟的方法。 他们试用8株猪瘟病 毒感染家兔，一周后用猪瘟兔化弱毒(C系)攻击，结果7株病毒可以产生免疫力，在以兔 化弱毒攻击后不发生热反应。而感染出血性败血症、猪丹毒或炭疽的耐过兔，则在兔化 弱毒攻击时，发生热反应。诊断临床病料时，可采病猪的脾脏或淋巴结和肾脏的混合乳 剂或血液，经耳静脉接种家兔，每天测温3～4次，一周后， 再经耳静脉接种10-2C系 兔化弱毒或其100个50%兔发热剂量(DH50)。同样每天测温，并根据体温反应判定结果 。 表22-1 诊断猪瘟的兔接种试验(举例) 热 反 应 结 果 判 定第1次注射第2次注射第1 次注射结果存在的病毒－－获得免疫(无热反应) 强 毒－＋未免疫(无热反应) 没有病毒＋－获得免疫(有热反应 )兔化毒＋*＋未免疫(有热反应) 没有病毒 *系非特异性热反应，可能是接种材料细菌性污染的缘故。热反应是指家兔在接种后，体温上升，超过常温1℃以上(或超过405 ℃以上)。 被检材料中含有猪瘟病毒时，第1次注射后出现热反应，证明是兔化弱毒。 但也可 能不出现热反应，且在第2次接种兔化弱毒时也不出现热反应， 则证明被检材料中含有 强毒，因野外强毒尚未适应兔体，不引起热反应，但使家兔产生免疫力， 故在第2次接 种兔化弱毒时，也不发生热反应。本法优点是能检出被检材料中可能存在的强毒病毒和 兔化弱毒株，且能予以鉴别，但需8天才能获得结果。
(2) 琼脂扩散试验：虽可选用病猪的脾、淋巴结和回肠小段作为抗原，但以胰腺最好 。另需具备特异性好的猪瘟高免血清。本法操作简单，但敏感性较低，肯定是猪瘟的病例 的阳性率也低于50%。欧洲一些国家， 如英国的某些诊断实验室专门制备高价免疫血清 和抗原，并有统一的判定标准。 用pH86的巴比妥缓冲液配制12%琼脂，内加1/万柳硫汞防腐。按中央1孔、 周围6 孔的模式打孔。孔径5mm，孔间距6mm。检测抗原时，将高免血清滴入中央孔内，周围孔 内分别滴加标准抗原和待检病料乳剂。检测抗体时，将标准抗原滴入中央孔内，周 围孔上、下两孔内滴加高免血清，其它4孔分别滴加被检血清。
(3) 免疫荧光试验：主要用于检测病毒抗原，但也可以检测抗体。 应用荧光抗体，可在宿主器官的抹片或冰冻切片中发现病毒抗原，也可先将可疑病 料乳剂接种细胞培养物(最常应用PK15细胞系)，随后再用荧光抗体检出感染细胞。 直 接检查病料时，采取扁桃体、脾、淋巴结和胰腺制备冰冻切片或抹片，应用直接或间接 法荧光抗体进行检测。日本Sawada设计了一个从活猪采取扁桃体标本的器械，成功地 在扁桃体隐窝抹片中找到上皮细胞内的猪瘟病毒抗原。从检测结果来看，发病早期扁 桃体的检出率较高；而于感染后期，胰腺中的病毒抗原检出率高于其它脏器。强毒病 毒抗原的荧光明显，且可见于许多上皮细胞和淋巴细胞的胞浆内。弱毒病毒抗原通常只 能见于扁桃体隐窝上皮的胞浆内，荧光呈斑点状， 例如接种C株兔化弱毒疫苗的猪仅能 在注苗一周左右在扁桃体中找到弱的荧光斑。 如上述，检测病毒抗原的另一个方法是将被检材料接种PK15细胞系， 随后用荧光 抗体染色。感染细胞呈局限性集团，形成荧光斑点。计数斑点，可以粗略滴定被检材料 中的病毒含量。Mengeling建议在接种被检材料并吸附后， 加入含有抗血清 的营养液进行培养。加入抗血清的目的是防止病毒从细胞释放出来，构成第二次感染。 必须指出，牛腹泻粘膜病病毒与猪瘟病毒的抗原性一致，也能结合猪瘟抗体。 但 因BVDMD病毒对猪并无明显病原性，也不能在猪体内充分增殖，因此不致干扰诊断结果。 且因BVDMD病毒可在细胞培养物上引起细胞病变，鉴定并不困难。 免疫荧学技术的关键因素，是用高效价的特异性免疫血清，提取IgG， 进行荧光素 标记。染色时将荧光抗体作尽可能高的稀释，以便消除非特异性染色，并且设置多种对 照，包括已知的阴、阳性标本以及荧光抑制试验等等，请参阅本书第十四章。
(4) 血清中和试验：由可疑脏器分离病毒，结果常不满意，特别是在非典型和慢性病 例，因为其中病毒含量甚少，且因经常同时存在抗体，病毒有被抗体中和的危险。血清 中和试验可以测出动物体内的抗体，但因推广应用弱毒疫苗，猪群中的猪瘟抗体滴度普 遍较高，故应进行双份血清的检查(前后相差14天以上)，才能确立抗体滴度增高与现症 的关系。 由于非典型猪瘟病例对血清学变种331株病毒的阳性反应频率增加， 故在应用血清 中和抗体试验诊断猪瘟时，需要应用331毒株和标准毒株同时进行检验。 目前最常应用的血清中和试验方法是免疫荧光中和试验——定量病毒加不同稀释度 的被检血清。同时以SPF猪血清作为阴性对照，以高免血清作为阳性对照。 所有血清均经56 ℃ 30分钟灭活。然后按下列步骤进行中和试验。 应用内含05%乳白蛋白水解物和25mmol/L的MgCl2 6H2O(即每1 000ml中含507g) 的Earle液稀释病毒和被检血清。被检血清按4×连续稀释，由1∶4至1∶1 024。取不同稀 释度的血清分别和等量病毒液混合，置37℃感作1小时，随后接种飞片上的PK15细胞培 养物。同时设置各种对照组。再培养18～24小时，取出后作免疫荧光抗体检查。计数各 飞片中荧光细胞灶的数目。与对照组比较，凡能减少90% 荧光细胞灶的血清稀释度就是 该血清的终点滴度。1∶4血清组的荧光细胞灶减少不到90%者，判为阴性。 也可应用Gillespie的“PAV1毒株”，因其可以产生细胞病变，并被特异免疫血 清所中和。血清处理方法相同。将PAV1株病毒稀释成每05ml含100TCID50， 随后加 入等量稀释血清，混合后置室温感作90分钟，接种细胞管，37℃培养3～4天后读数。同时 设置不加血清的病毒对照组。按不同稀释度血清抑制病毒产生细胞病变的管数，计算被检 血清的中和效价。
(5) 新城疫病毒强化法：在一定条件下，先被猪瘟病毒感染的猪睾丸细胞，在随后再 感染新城疫病毒时，可以产生细胞病变。这一现象被用来检测猪瘟病毒，称为新城疫病 毒强化法，简称END(Exaltation of NDV)。直接法END(将被检病料直接接种细胞培养物) 的敏感性较低，但如改用两步法，亦即先将被检材料接种猪脾细胞培养物，传代适应之 后再作END试验，则可明显提高其敏感性，几乎能与易感猪接种法相等。 具体方法是在 猪睾丸细胞培养物中接种被检材料(猪瘟病毒)，37℃培养4天，随后接种106个蚀斑形成 单位的新城疫病毒，继续培养3天。根据是否出现细胞病变进行判定。同时设对照组。 如果细胞培养物出现病变，即表示有猪瘟病毒存在。 杨兴业等成功地应用END法于猪瘟血毒毒价的测定。 END法适于检测那些易在猪源细胞中生长的野外毒株，对大部分兔化弱毒株无效， 因其往往不能在猪睾丸细胞内充分增殖。
(6)免疫酶测定技术或酶标记抗体诊断法：Saunder等报告并肯定 了应用快速酶标记抗体微量技术检查猪瘟抗体的诊断方法。 先用PK15细胞增殖猪瘟病 毒作为抗原，包被微量滴定板，随后加入被检血清(第一抗体)，冲洗后再加酶标记的兔 抗猪γ球蛋白，再经冲洗，最后加入底物显色。Saunder通过640份血清检验结果， 证明酶标记抗体法和血清中和试验的符合率在99%以上。 但中和试验需要18小时才能获 得结果，酶标记抗体仅需1～2小时。 必须指出，Saunder等的上述结果是用酶标记抗体按间接法检测猪瘟抗体。 由于 我国普遍开展兔化弱毒疫苗的预防注射，猪血清中几乎都有猪瘟抗体，给酶标抗体诊断 法带来困难。 丘惠深等分别应用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出可以鉴 别猪瘟兔化弱毒、 猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒及边界病病毒的特异性猪瘟兔化弱毒单抗及猪瘟石门株单抗。 用亲和层析法制成单抗酶联试剂后，可将疫苗注射血清、强毒感染血清、混合血清和 猪瘟阴性血清区别开来。房德兴等建立了单克隆抗体ELISA抑制法，用于检测细胞培养物中的猪瘟兔化弱毒 ，可望取代兔体接毒试验检测疫苗效价。 我国谢昕等人设计用酶标记抗体直接检测病猪组织和白细胞中的病毒抗原， 获得初步成功。该氏等通过10头实验感染猪和10头非猪瘟猪的白细胞和不同脏器的检查， 证明检出率和特异性都较高，而且实验猪即使接种过疫苗，干扰也不明显。人工感染石 门系强毒24小时后，即可从病猪外周血液的白细胞中检出病毒抗原。而10头非猪瘟猪的 白细胞全呈阴性结果。为排除非特异性反应，酶抗体结合物在纯化后， 还需用非免疫 健康猪的组织粉(肝粉或脾粉等)和红细胞进行吸收。检测试验中则应注意消除组织细胞 中自身含有的过氧化物酶，即内源性酶。谢昕等应用内含001%过氧化氢的001%叠氮化 钠溶液抑制内源性酶，取得较好效果。 从脾、肝和扁桃体等脏器的检出率来看，脾脏和肝脏的检出率高，扁桃体的检出率 较低。感染猪瘟的肾脏皮质部细胞被染成黄棕色，尤其在肾小球囊周围最为明显，说 明猪瘟病毒在肾的皮质部增殖。扁桃体的检出率低(6/10)，可能与濒死期采集标本有关， 因扁桃体此时大多已经化脓坏死。 Wensvoorf等和Edwards等各自研制成功分别对HCV、瘟病毒属其它病毒、 整个瘟病毒属特异的单克隆抗体， 结合酶联免疫吸附试验可以准确诊断HCV在猪体的 感染并与感染其它两种反刍动物的瘟病毒区分开来。 Shannen等用抗原捕获ELISA检测感染HCV的血液和组织样品， 能在感染猪即将显示猪 瘟症状时，快速、敏感地予以检出。
(7)RTPCR法：Liu等报道了用RTPCR快速检测感染组织中的HCV。 从感染HCV的组 织中提取总RNA，以此总RNA为模板,进行反转录合成第一链cDNA，然后在两个 HCV特异引物存在的情况下用TaqDNA聚合酶进行扩增，合成HCV特异的双链cDNA。扩增的 DNA片段用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法的敏感性可达104TCID50的HCV。 当用 巢式 引物扩增时，敏感性可提高1 000倍。 该方法可能对HCV的病原学和流行病学研究很有用 途。
(8)髓细胞检查法(Medullogram Test)： 这是1975年由罗马尼亚Manolescu提出的 方法，据云可对急性猪瘟强毒感染进行鉴别。 在发病初期，采取病猪胸骨的髓浆，制成抹片，姬姆萨染色后作形态学检查。如出 现副淋巴母细胞型单形态细胞(Paralymphoblasts type monomorphous cells)的增生， 则是强毒猪瘟的特征，猪感染C株兔化弱毒疫苗时不产生这种细胞。 检查髓细胞的优点是不需要细胞培养物。在农村条件下，杀1～2头临床病猪，采取 骨髓浆汁抹片(胸骨头或肋软骨部分)，两小时就可得出结果。欧洲有些国家已经推广应 用。 此外，某些学者应用免疫电泳法(Immunoelectroosmophoresis,IEOP) 和改良补体结 合试验于猪瘟诊断，也已获得有希望的结果。
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