正粘病毒化学组成及其功能
流感病毒由68%～70%的蛋白质、1%～2%的核糖核酸(RNA)、20%～25%脂质和5%～8%的糖组成。病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。
(1) 正粘病毒基因组组成
〖HT5SS〗流感病毒的基因组是由8个分节段的单链、负股RNA组成，其中4、6号两个节段编码病毒囊膜糖蛋白，比较而言，丙型流感病毒仅编码单一表面糖蛋白，因而丙型流感病毒的基因组由7个RNA节段组成。流感病毒基因组片段具有共同的特点：所有的RNA节段均具有相同的5’端，它由13个核苷酸所组成；3’端由12个高度保守的核苷酸组成，靠近3’端的第四个碱基，有些毒株为U，有的为C。在这些共同序列中，有部分序列可反向互补，这一点对病毒RNA的复制很重要；在每一节段靠近5’端15～21核苷酸处有一保守区，其序列为polyU。这一保守区在病毒mRNA合成时是产生polyA的信号。因为每一RNA节段的3’和5’端有部分序列互补,所以每个RNA节段呈锅柄环状。第1～6个节段各编码一个病毒蛋白，7、8节段则编码2个病毒蛋白，这样甲、乙型流感病毒具有10种蛋白多肽，推论丙型流感病毒具有9种蛋白多肽，可目前仅证实8种。核酸具体编码见表24-3。由于流感病毒的基因组分节段的结构特点，导致了基因组的易变性和具有很高的重组率。流感病毒RNA总分子量为59～63MD。甲、乙和丙型流感病毒基因组的大小和碱基组成不尽相同，AU∶AC的比率甲型为1:25；乙型为1:42；丙型为1:46。提纯的流感病毒RNA不具有感染性，需与一些具有多聚酶活性的蛋白结合在一起才具有感染性。
(2) 正粘病毒核蛋白(NP)
流感病毒的核蛋白，分子量约60kDa，是单体磷酸化的多肽，是构成核衣壳的主要成分。核蛋白具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型，它是可用补体结合试验方法测定的型特异抗原，即可溶性抗原。它没有感染性，在病毒粒子内部卷曲成螺旋状结构，是病毒核酸外面的一种蛋白质，但它并不把核酸完全包被起来，因而核衣壳仍对核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解后，核蛋白亚单位仍然存在，推测核蛋白自身形成一种内聚结构。核蛋白是一种多功能蛋白质，除了形成病毒的核衣壳外，在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用。在确定病毒的宿主特异性方面也有作用，例如根据对许多流感病毒NP基因的研究，可将它们分为5个不同的组，所有的禽流感病毒分为两个组，马流感病毒分为两个组，猪流感病毒分在一个组。核蛋白的磷酸化取决于宿主细胞，与病毒感染的宿主谱有关。核蛋白分子至少具有3个独立的抗原位点，借助于单克隆抗体和多克隆抗体进行研究，发现所有被测毒株都有一个共同位点，针对这一位点的单抗可抑制病毒RNA分子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护，用提纯的NP免疫动物，也只能产生很微弱的抗感染能力，但NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。
(3) 正粘病毒基质蛋白(matrixproteins,MA)
基质蛋白是一种非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA节段、丙型流感病毒的6RNA节段编码。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的内侧，也称为内膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有两个读码框架，可转录出两个mRNA，分别翻译出一种蛋白质。因此流感病毒的基质蛋白有两种，即M1和M2。M1由252个氨基酸残基组成，分子量约26kDa，它是病毒的主要结构蛋白，占流感病毒蛋白总量的40%。这种蛋白也具有型特异性，其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。M1位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白。另外M1还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现。研究表明，M1的氨基端含有一亲水区，羧基端与病毒的转录酶之间相互作用。流感病毒的M1具有多种功能，除维持病毒粒子的形态外，还能调节病毒转录酶的活性，另外在子代病毒粒子装配过程中也起重要作用。据报道，M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。M2由97个氨基酸残基组成，分子量大约为15kDa，由片段7转录的第二个小mRNA翻译出。M2也是一种跨膜蛋白，主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上，另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。每个病毒粒子大约含有14～68个M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值；在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外在病毒装配过程中也起作用。流感病毒M2的氨基酸序列很保守，在所检测的毒株中，其同源性高达90%。这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端在细胞内。细胞外部分为18～23个氨基酸，19个氨基酸残基组成的疏水区插入细胞膜内，羧基端的54个氨基酸位于细胞质内。氨基端的10个氨基酸非常保守，在所测的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。研究表明，针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒蚀斑的增大，其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同。用这种单抗筛选突变株时，不仅引起M2的突变，还能引起M1的突变。
(4) 正粘病毒聚合酶(polymerase)
流感病毒的聚合酶由三种成分组成，它们是PB1、PB2、PA。这三种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质，分别为PB196kDa，PB287kDa，PA85kDa。这三种蛋白质在氨基酸序列上有一共同特点，都含有一特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。所以在感染细胞的细胞核内都可发现这三种蛋白成分。流感病毒聚合酶复合体在病毒粒子中所处的位置目前已经清楚。三种蛋白质位于病毒基因组的3’末端，免疫电镜技术已直接观察到这一复合体位于每一个核壳体的一端。聚合酶复合体的三种成分分别由不同的基因组片段编码。PB1由片段2编码，共757个氨基酸残基。其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长；在模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)的合成过程中也靠PB1的作用使合成链增长。PB2由片段1编码，大约759个氨基酸残基。其作用是在病毒mRNA转录的起始阶段，识别并结合在5’端I型帽子结构。另外它还具有限制性内切酶活性，参与宿主mRNA帽子结构的切割。PB2在病毒cRNA和vRNA合成过程中的作用还不清楚，因为这些过程不需要宿主mRNA的帽子结构做引物。PA由片段3编码，由716个氨基酸残基组成。在病毒RNA转录和复制过程中，PA与PB1和PB2在一起随链的延长而移动，因此推测PA与PB1和PB2共同构成RNA聚合酶复合体。但PA在病毒RNA合成过程中的作用还不清楚，有人认为可能是一种蛋白激酶或解旋蛋白。
(5) 正粘病毒非结构蛋白(nostructuralproteins,NP)
甲、乙型流感病毒的非结构蛋白由片段8编码，丙型流感病毒由片段7编码。片段8或7也有两个读码框架，可编码两种蛋白质即NS1和NS2，两者的分子量分别为25kDa和12kDa。主要在胞浆内，在病毒粒子内不存在这两种蛋白成分。流感病毒非结构蛋白的功能还没有彻底搞清，可能在病毒复制过程中起一定作用，NS2还可能有调节非结构蛋白合成的作用。在细胞感染流感病毒的早期就可发现细胞核内有大量的NS1聚集，另外还可在细胞浆内发现。NS2合成较晚，主要存在于细胞胞浆，也可在细胞核内发现。序列分析表明，NS1和NS2有70个氨基酸的重叠，并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。NS1蛋白含有两个核定位信号区，其中34～38位氨基酸残基处的信号区非常保守，在所有甲型流感病毒中都相同。第二个信号区在203～237位氨基酸残基处，在大多数甲型流感病毒中都有这一序列。野外分离的禽流感病毒的某些毒株，NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失现象。不同亚型毒株的NS在带电性和磷酸化方面有很大差异。用多克隆抗血清对NS1的抗原性进行研究，结果发现，不同亚型毒株之间存在明显的交叉反应。从人、猪、马分离的甲型流感病毒，其NS1的抗原性非常相似，一般方法难以区分，而禽流感病毒株的NS1其抗原性有变异。
(6) 正粘病毒脂质层
由内、外两层构成，紧靠于内膜蛋白之外。脂质占病毒粒子总重量的20%～25%，使病毒对乙醚和其它脂溶剂敏感。HA和NA亚单位的疏水性末端即植入于这个脂质层内。流感病毒的脂质与副粘病毒相似，主要来自宿主细胞，由磷脂、胆固醇和三甘油脂组成，其中磷脂和胆固醇占95%以上。
(7) 正粘病毒宿主抗原
在不同种动物细胞中生长的流感病毒粒子，带有各该动物细胞的宿主抗原。例如，在鸡胚细胞中培养的病毒，给家兔进行免疫注射，不仅使其产生抗病毒抗体，而且还能产生抗鸡胚细胞的抗体。宿主抗原占病毒总重量的5%，分子量为15kDa，大部分是糖。宿主抗原连结于病毒表面蛋白上，可能是HA和NA的糖蛋白中的糖组分。抗宿主抗体主要针对宿主细胞的糖。
(8) 正粘病毒血凝素
血凝素(HA)是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多种动物红细胞的性质，借助HA对细胞受体的作用，使病毒附着于细胞，在穿膜过程中起关键作用。HA具有诱生中和抗体的能力，产生免疫保护作用。HA可以直接通过血凝反应检测，其抗体可用血凝抑制、中和试验、补反和ELISA方法来检测。流感病毒的HA呈三角细长的棒状构造。HA为75kDa的糖蛋白，可水解成两个独立的肽链,两个多肽由二硫键连接在一起。HA水解成HA1和HA2是感染的先决条件。HA的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA由甲、乙型流感病毒RNA片段4编码，是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。免疫学和生物化学方法研究证明，HA在细胞内质网合成。合成后由内质网运送到高尔基复合体，最后到达细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰，如将N－葡萄糖苷寡糖加到天门冬酰胺残基上，有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。修饰的位置随毒株不同而有区别。这样形成的单体HA分布在内质网膜上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠成一定的形状，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时，还经过几个切割加工过程，包括N端信号肽的切除及HA1和HA2的产生。N端的信号肽约由16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网膜。HA合成后由信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链，产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基，这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为36kDa和27kDa，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其它非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。HA的一级结构〓根据对不同亚型毒株HA的氨基酸序列测定及根据其片段4的核苷酸序列推测，HA大约由562～566个氨基酸残基组成。在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽，在加工过程中被信号肽酶切掉。紧接信号肽的328个氨基酸残基是HA1部分，羧基端的221个氨基酸残基构成HA2。在HA1和HA2之间有一精氨酸残基，在加工过程中被切掉。经过切割后产生的HA1和HA2由一个二硫键和许多非共价键连在一起，两条肽链之间的二硫键在HA1的14位和HA2137位的半胱氨酸之间形成。另外在HA1和HA2分子内还有其它的二硫键。HA2的羧基端(185～211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成，HA靠这一部分插入病毒囊膜的脂质双层。最末端的10个氨基酸残基多数是亲水性的，因此可伸出脂质双层进入病毒粒子内。HA是一种糖蛋白，每一个HA单体分子上带有7个寡糖链，其中6个在HA1，1个在HA2。这些寡糖链都通过N－葡萄糖苷键与天门冬氨酸残基相连。HA中寡糖的总量约占20%，主要由氨基葡萄糖组成，一些甘露糖形成枝状结构，此外还有少量的岩藻糖，其最外端是半乳糖。在其它病毒糖蛋白的寡糖末端常带有唾液酸(N－乙酰神经氨酸)，但流感病毒没有，这是由于病毒粒子含有神经氨酸酶的缘故。 目前对大多数亚型的HA已经测序，通过序列比较发现半胱氨酸残基在所有亚型的序列中都很保守。这表明它们从一个共同的“祖先”进化而来，并且表明它们的结构都相似。通过部分氨基酸序列的比较发现，H1和H3亚型差别最大，仅25%的同源性；其它亚型之间的同源性较高，H2与H5亚型HA之间序列的同源性最高，为80%；相同亚型的不同毒株之间，HA序列的同源性在90%以上。 HA的三维结构〓流感病毒囊膜表面的纤突是三个HA聚合在一起形成的三聚体。用去污剂将病毒粒子裂解后可分离到完整的HA纤突。当把去污剂除去后，HA分子靠其疏水端聚集在一起形成玫瑰花样。用蛋白水解酶(如菠萝蛋白酶)消化某些毒株，可分离到不完整的HA分子。HA纤突由三个HA单体分子组成，单体可分为两部分，一部分是呈球状的头部，含有受体结合位点和抗原决定簇；另一部分为柄，与囊膜相连，长约7.6nm。三聚体的总长为135nm。用X线衍射技术对HA研究的结果表明，HA1的氨基端和HA2的羧基端位于分子的末端，并且靠近囊膜。球状头部由HA1组成，茎部由HA2和部分HA1组成。在HA头部和茎部各单体之间都有局部接触，这样使之形成的三聚体更加稳固。
(9)神经氨酸酶(NA)
神经氨酸酶是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N－乙酰基神经氨酸。病毒在细胞表面成熟时，NA可以移去细胞膜出芽点上的神经氨酸，有利于病毒粒子的成熟和释放。它具有免疫原性，能诱发相应的抗体。NA抗体可以抑制酶活性，并具有免疫保护作用。NA亚单位为四聚体，呈哑铃状，外端呈钉帽状，大小为9×5nm，内端呈结节状，直径4nm，像树根一样植入于脂质层内，两端由一长10nm的杆相连。NA亚单位的分子量为200kDa，它是由二个相同的并由二硫键连接的55kDa糖蛋白的二聚物，即由4个单体NA所组成，见图24-4。NA的酶活性可以进行定量测定。HA和NA是甲、乙型流感病毒的两种糖蛋白，而丙型流感则有一种糖蛋白，即血凝素—酯酶(hemagglutinin－esterase，HE)，具有HA的特性，又具有NA的酯酶活性。但丙型流感不具有NA活性。用去污剂、脂溶剂或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、链霉蛋白酶)处理，可使NA纤突从病毒粒子上释放下来。通过电子显微镜观察，发现释放的NA纤突呈蘑菇状。除掉去污剂后，这些纤突可通过疏水的茎部聚集在一起呈玫瑰花形。链霉蛋白酶处理释放的纤突，具有完整的酶活性和抗原性。病毒囊膜上的NA纤突是NA单体形成的四聚体，它包括一个蘑菇状的头部和一个细茎。
NA是一种糖蛋白，其蛋白部分由片段6编码。目前对绝大多数亚型毒株的片段6序列已经清楚，并能从基因序列推测出其氨基酸序列。通过对去污剂处理后释放的NA进行部分氨基酸序列分析，发现与基因推测的序列很一致。NA蛋白质序列的特点是翻译后不经过切割；信号肽不被除去；翻译起始用的蛋氨酸仍然存在；羧基端也不曾经过加工。NA与HA不同，它属于II类糖蛋白，即氨基端在囊膜内而羧基端在囊膜外，与HA正好相反。NA的一级结构包括4个区域，分别为氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和头部序列。NA的氨基端胞浆尾包括6个氨基酸残基。根据目前所检测的不同亚型的NA序列，发现氨基端胞浆尾非常保守，在所有的甲型流感病毒中都相同。这表明这一序列可能具有重要功能，但其真正功能目前还不清楚。NA的非极性跨膜区包括氨基端7到35位的氨基酸残基，其中前6个比较保守，其余23～25个氨基酸变异较大。用去污剂和链霉蛋白酶处理提取NA后进行序列分析，证明非极性跨膜区的作用是将NA固定于脂质双层；NA合成后在内质网的运输过程中，这一序列起信号肽的作用。非极性跨膜区的长度在不同的亚型之间有差别。NA的茎部长度及序列在不同的毒株也有很大的差异。茎部的主要功能是帮助形成NA四聚体，当四聚体形成后，用链霉蛋白酶可将其茎部切下，而剩余的四聚体头部仍可保持正常的结构，并且抗原和酶活性都不受影响。茎部是否还有其它功能，目前还不清楚。NA的头部序列在不同亚型的毒株有较高的同源性(46%)，这一点与茎部和非极性跨膜区不同。用链霉蛋白酶处理将NA茎部和跨膜区除去，获得NA的四聚体头部，通过X线晶体衍射技术研究表明，四聚体头部大小为100×100×60nm，由4个相同的单体构成。每一个单体由6个β折叠组成，每个折叠又由4条反平行排列的肽链组成。每个折叠的立体构型都相同，呈螺旋桨叶片状，按逆时针方向排列。连接β－链的茎环结构在不同亚型之间的差异，其氨基酸的变化是造成NA酶活性和抗原性变异的原因。NA酶活性的催化中心位于头部顶端，呈凹隐状，每个NA单体都有一个，所以HA纤突具有4个催化中心。研究表明，每个NA纤突有4个抗原位点，每个位点又含有多个抗原决定簇。
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