大肠菌群及大肠杆菌测定（FDA与ISO对比）

大肠菌群的定义

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。 

 

大肠杆菌的定义

大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。

大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。

与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

 

卫生学意义

大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。

食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。

大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

 

大肠杆菌的生物学特性

 

基本形态：

此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

 

培养特性：

大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。

大肠菌群及大肠杆菌测定
  ——MPN法检验流程（FDA BAM）

1、检样50g+450ml稀释液

2、适当十倍稀释样品

3、选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL。在35℃下 ，培养24 ± 2h ~48 ± 2h。

4、（1）没有产气管→报告阴性

（2）有产气管：①接种BGLB肉汤管→查MPN表报告结果（大肠菌群）

                            ②接种EC肉汤 →在44.5±0.5 ℃ （水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h。

                            →产气管接种EMB平板（35℃、18~24h），从EMB平板上挑取5个可疑菌

                            转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气  

                            →查MPN表报告结果（大肠菌群）。               

大肠菌群测定——MPN法检验几点说明

   MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。

    1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

    2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

    在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别

EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：                     

中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽

大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别

EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；

大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；

该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。

 

大肠杆菌测定——革兰氏染色

基本步骤：

将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；

滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；

滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。