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李斯特菌检测(FDA与ISO对比)



录入时间:2009-8-12 11:17:11 来源:食品伙伴网

李斯特菌属简介
《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中,李斯特菌属有7个种:单核细胞增生李斯特氏菌(L. monocytogenes)、英诺克李斯特氏菌(L. innocua) 、西尔李斯特氏菌(L. seeligeri) 、威尔斯李斯特氏菌(L. welshimeri) 、绵羊李斯特氏菌(L. ivanovvi) 、格氏李斯特氏菌(L. grayi) 、默氏李斯特氏菌(L. murrayi) 。
单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌,可引起动物的感染,也可引起人的感染。
 
单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性
形态特征:
     革兰氏阳性短杆菌,大小为0.4~0.5×0.5~2μm,  两端钝圆,常两两相串成弯曲及V形,偶尔有球状、双球状、短链状,但很少有长链状,兼性厌氧、无芽孢,一般不形成荚膜。该菌有4根周毛和1根端毛,周毛易脱落。20℃培养后可见到很多鞭毛。
 
培养特性:
l生长温度为2~42℃(冷藏不能阻止该菌的生长),最适生长温度为35~37℃。20~25 ℃培养有动力,37 ℃培养动力消失;在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。
l在pH3.8~4.4仍能生长,在pH中性至弱碱性(9.6)、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好,在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。
l血平板上:菌落通常不大呈灰白色,刺种血平板可产生窄小的β溶血环。
 
FDA BAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程
1、增菌:检样25g+EB增菌液基础225mL,在30℃下培养4h。
2、选择性分离培养:加入抑菌剂(1)在30℃下培养20h →  接种OXA和 PALCAM,在35℃下培养24-48h。
                             (2)在30℃下培养44h → 接种OXA和PALCAM,在35℃培养24-48h。
3、生化鉴定:TSA-YE纯培养,在30℃下培养24-48h。
(1)典型运动、过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验。
(2)TSB-YE:甘露醇、木糖、鼠李糖、七叶苷、葡萄糖、麦芽糖、SIM动力、硝酸盐还原试验。
ISO单核细胞增生李斯特氏菌检验流程
1、测试样品(x g或x mL)+9x mL一次增菌培养基(Half Fraser肉汤),在30℃培养24±2h。
2、(1)1mL培养液加入10mL二次增菌培养基中 (Fraser肉汤)在35℃或37℃培养48±2h→划线接种Oxford琼脂和PALCAM琼脂,在30℃、35℃或37℃培养24-48h
  (2)划线接种Oxford琼脂和PALCAM琼脂,在30℃、35℃或 37℃培养24-48h。
3、李斯特菌属的确证:挑取可疑菌接种TSAYE培养基、过氧化氢酶试验、革兰氏染色、
动力试验。
4、单核细胞增生李斯特菌的确证:溶血试验、碳源利用试验、CAMP(协同溶血)试验。
                                                               
单核细胞增生李斯特氏菌——溶血试验
制备5~7%羊血琼脂平板。
挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板,刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂,同时接种阳性(单核细胞增生李斯特氏菌)和阴性(英诺克李斯特氏菌)对照。
单增呈现狭窄、清晰、明亮的β-溶血;
西尔李氏菌出现弱的溶血现象;
绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的β-溶血;
英诺克李氏菌不产生溶血现象。
单核细胞增生李斯特氏菌——协同溶血试验(CAMP)
方法:在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌(S.aureus)和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌,与两线相近但不相交,在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。
结果:靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强,西尔李斯特氏菌的溶血也增强,绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
 
ISO李斯特氏菌鉴定反应
 
种别
溶血性
产酸
CAMP试验
鼠李糖
木糖
金黄色葡萄球菌
马红球菌
L.monocytogenes
L. innocua
L. ivanovvi
L. seeligeri
L. welshimeri
L. grayi
L. murrayi
+
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(+)
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+
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v: vatiable reaction
(+): weak reaction
+: >90% of positive reaction
-: no reaction
 
FDA李斯特氏菌属的区别
种别
溶血性
毒力a
糖发酵c
甘露醇
鼠李糖
木糖
L.monocytogenes
L. ivanovvi
L. innocua
L. welshimeri
L. seeligeri
L. grayi
L. murrayi b
+
+
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+
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+
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+
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v
v
-
v
v
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-
+
+
-
+
-
a: mouse test
v: variable biotypes
b: 硝酸盐还原试验阳性,其它种该反应为阴性。
c: 葡萄糖、麦芽糖、七叶苷糖发酵试验全部为阳性。
 
几种常用稀释缓冲液介绍
磷酸盐缓冲液
    储备液的制备:称取34g磷酸二氢钾溶解于500ml蒸馏水中,用1NNaOH
    溶液调整pH值为7.2,再用蒸馏水稀释至1000ml,121℃高压灭菌
    15min,于冰箱中储存。
    稀释液的制备:取1.25ml储备液,用蒸馏水稀释至1000ml,定量分
    装,121℃高压灭菌15min备用。
0.85%生理盐水
    称取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸馏水中,定量分装,121℃高压灭菌
    15min备用。
0.1%蛋白胨水
    称取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸馏水中,定量分装,121℃高压灭菌
    15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用,不会因为在稀释
    过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。
 
                                
 
 
 
                                      
 

 

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