1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料
2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。
2.4 冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6 乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8 天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12 菌落计数器。
3 培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC 肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。
4 样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样
品中大肠菌群的MPN值。
6 粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
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靛 基 质┃ MR ┃ VP ┃ 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃典型大肠杆菌
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃典型中间型
－ ┃ ＋ ┃ － ┃ ＋ ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃典型产气肠杆菌
＋ ┃ － ┃ ＋ ┃ ＋ ┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8 大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接
种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×10**4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL)
附 录 A
培养基和试剂
(补充件)
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤
胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL
0.1％煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水 1000.0mL
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0～7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。
A3 EC肉汤
胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g
琼脂 15.0g
伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝 0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸馏水 1000.0mL
在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液,摇匀,冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。
A６ 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨 10.0g
蒸馏水 1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。
A7 MR-VP培养基
(月示)胨 7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。
A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。
A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂 15～18g
蒸馏水 1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。煮沸2min,将培养基冷至45～50℃倾注平板。临用时制备,不得超过3h。
A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。
稀释液
取贮存液1.25mL, 用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。
A11 生理盐水
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
A12 革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇 20.0mL
1％草酸铵水溶液 80.0mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0mL
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
沙黄复染液：
沙黄 0.25g
95％乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
染色法
a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。
b. 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
d. 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
A13 Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇 75.0mL
盐酸(浓) 25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。
A14 甲基红指示剂
甲基红 0.1g
95％乙醇 300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。
A15 Voges-Pros kauer(V-P)试剂
甲液
α-萘酚 5.0g
无水乙醇 100.0mL
乙液
氢氧化钾 40.0g
用蒸馏水加至 100.0mL
附 录 B
1g检样中最近似值(MPN)表
(补充件)
使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳 性 管 数 ┃ ┃ 阳 性 管 数 ┃
━━━━━━━━━┫ MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001 ┃ ｜ 0.1 0.01 0.001 ┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
0 0 0 ┃ ＜3 ┃ 2 0 0 ┃ 9.1
0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃ 14
0 0 2 ┃ 6 ┃ 2 0 2 ┃ 20
0 0 3 ┃ 9 ┃ 2 0 3 ┃ 26
0 1 0 ┃ 3 ┃ 2 1 0 ┃ 15
0 1 1 ┃ 6.1 ┃ 2 1 1 ┃ 20
0 1 2 ┃ 9.2 ┃ 2 1 2 ┃ 27
0 1 3 ┃ 12 ┃ 2 1 3 ┃ 34
0 2 0 ┃ 6.2 ┃ 2 2 0 ┃ 21
0 2 1 ┃ 9.3 ┃ 2 2 1 ┃ 28
0 2 2 ┃ 12 ┃ 2 2 2 ┃ 35
0 2 3 ┃ 16 ┃ 2 2 3 ┃ 42
0 3 0 ┃ 9.4 ┃ 2 3 0 ┃ 29
0 3 1 ┃ 13 ┃ 2 3 1 ┃ 36
0 3 2 ┃ 16 ┃ 2 3 2 ┃ 44
0 3 3 ┃ 19 ┃ 2 3 3 ┃ 53
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
1 0 0 ┃ 3.6 ┃ 3 0 0 ┃ 23
1 0 1 ┃ 7.2 ┃ 3 0 1 ┃ 39
1 0 2 ┃ 11 ┃ 3 0 2 ┃ 64
1 0 3 ┃ 15 ┃ 3 0 3 ┃ 95
1 1 0 ┃ 7.3 ┃ 3 1 0 ┃ 43
1 1 1 ┃ 11 ┃ 3 1 1 ┃ 75
1 1 2 ┃ 15 ┃ 3 1 2 ┃ 120
1 1 3 ┃ 19 ┃ 3 1 3 ┃ 160
1 2 0 ┃ 11 ┃ 3 2 0 ┃ 93
1 2 1 ┃ 15 ┃ 3 2 1 ┃ 150
1 2 2 ┃ 20 ┃ 3 2 2 ┃ 210
1 2 3 ┃ 24 ┃ 3 2 3 ┃ 290
1 3 0 ┃ 16 ┃ 3 3 0 ┃ 240
1 3 1 ┃ 20 ┃ 3 3 1 ┃ 460
1 3 2 ┃ 24 ┃ 3 3 2 ┃ 1100
1 3 3 ┃ 29 ┃ 3 3 3 ┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。
━━━━━━━━━━━
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进
出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。
本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施
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