将基因克隆入AdEasyTM转移载体

 

  AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。Shuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。   

表1 AdEasyTM转移载体特性

载体名称 克隆能力 启动子 polyA位点 克隆位点 线性化位点 说明

pShuttle 7.5kb — — MCS 共转化位点PmeI（ECoRI） 

转染位点（PacI） 将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS） 

pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点PmeI（ECoRI） 

转染位点（PacI） CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白

 

4.1.1 克隆的一般原则

AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：

1） 在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。

2） 重组腺病毒质粒在转染QBI-293A细胞之前也必须用PacI进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI位点，如果有则必须进行定向突变。

3） 克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表1，建议插入基因的长度最好不超过它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。

 

4） 如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。 

5） 在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详细的操作方法，但在CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。

 

6） 载体DNA可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA进行转化和转染实验，因为污染的DNA将大大降低菌落和空斑的形成数。

 

4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体

构建重组AdEasyTM转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。 

1． 若cDNA含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，可以使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位点的引物进行PCR或连接含有酶切位点的接头使cDNA产生新的酶切位点。PCR插入酶切位点的方法较快速，但对于长cDNA则应使用连接接头，因为在扩增过程中Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。

2． 插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或PCR的方法。

3． 转化之前用PmeI或EcoRI将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。

4． 琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65℃ 20分钟进行灭活。

5． 凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。