AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增

  将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增：转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。

1． 将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。

2． 将1-5ul DNA加入40ul DH5α感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。

3． 将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。

4． 按照说明转化DH5α：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。

5． 将转化混合液重悬于1ml LB中。

6． 转入15-50ml离心管中，37℃振荡培养60分钟。

7． 培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α（1:10、1:100和1:1000）

8． 取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养24小时。未用的转化液可在4℃保存-2周。

9． 每个重组子挑1~3个克隆转入5ml LB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。 

10． 用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。