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腺病毒感染力测定



录入时间:2009-8-17 11:47:34 来源:青岛海博

  这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。该实验至关重要,因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株,以及如果能应用则需要多少的病毒量(也就是需要大量扩增的程度)来完成整个研究。这个实验中,如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测β-半乳糖苷酶,Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照(β-半乳糖苷酶检测)亦可向昆腾公司购买,但由于病毒滴度太低而不适于直接进行实验,通常需要扩增以达到理想的病毒滴度(扩增步骤见5.6)。   腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样,其中尤以淋巴细胞株最难转导。
腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行,MOI为1~200,当测定淋巴细胞株时MOI可至1000。对大多数细胞株来说,1~50的MOI值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高MOI情况下,某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞产生毒性。无论MOI为多少,感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动,以使感染效果达到最佳。
1. 按5.2.1中所述方法在6孔板中用不同数量病毒感染细胞(合适的MOI范围),培养48小时。
2. 进行X-gal染色(见下述)。注意细胞与病毒培养后不必清洗细胞,在整个实验过程中让病毒留在培养液中。
 
5.4.1 X-gal染色 
1. 弃去培养液,用37℃预热的PBS冲洗一遍,然后加入足量固定液(戊二醛或多聚甲醛)以覆盖细胞,0.05%戊二醛室温孵育5~15分钟或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。
2. 弃去固定液,室温下用PBS彻底洗3遍:第一遍将冲洗液立刻弃去,第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。
3. 加入最小体积的X-gal溶液。  
4. 37℃孵育1至12小时(过夜),阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于4℃保存。
溶液: 
a) 戊二醛固定液 
使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为0.05%。
b) 多聚甲醛固定液 
1. 将2g多聚甲醛溶解在50mL预热至55℃的水中。
2. 加入2滴10 N NaOH,溶液将变澄清。
3. 待多聚甲醛溶解后,加入10mL 0.2M 磷酸二氢钠(2.76g/100mL)和40mL 0.2M 磷酸氢二钠(无水,3g/100mL)。  
4. 固定液在37℃条件下加入,在室温下固定。多聚甲醛固定液可在4℃最长保存一个星期。
c) X-gal溶液
用PBS制备(PH7.4):
20 mM氰铁酸钾 ( K3Fe(CN)6 )
20 mM氰亚铁酸钾 ( K4Fe(CN)6•3H2O )
2 mM MgCl2或MgSO4
使用前加入X-gal储存液(20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺),终浓度为1mg/mL。
上述三种X-gal染色用的溶液可在室温下保存数月,溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal储存液则可于-20℃在玻璃容器中储存,用箔包裹后避光保存

 

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