重组腺病毒的筛选和纯化

  腺病毒转移载体和腺病毒DNA通过在体同源重组产生重组腺病毒，这涉及到复杂的反应和基因重排或突变，导致病毒呈现不同的表型。虽然重组腺病毒DNA在细菌内重组后已筛选到含有插入基因，但我们还是建议按照下面的操作步骤对细胞内产生的重组腺病毒进行鉴定。

 

5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送

重组腺病毒的挑选取决于病毒表达蛋白和增殖的能力。比如有两个不同特性的克隆，第一个克隆蛋白表达很好而且病毒可增殖至5000VP/细胞，而第二个克隆虽然蛋白表达水平只达到第一个克隆的75%，但是却可以增殖到10000VP/细胞。扩增的时候，第二个克隆10L产量中的病毒数量即可达到第一个克隆20L的产量，这样当需要大量扩增病毒时第二个克隆是较好的选择，而且产物足以产生生物学效应。筛选方法的选择取决于病毒最终的应用。如果用于蛋白表达，那么必须使用能监测蛋白表达水平的方法；如果要挑选能有效扩增的克隆，那么就用能定量检测DNA产量的方法。简单的重组腺病毒筛选可用PCR方法，这一技术只检测病毒中的重组DNA，而不能筛选特定的表型。其它技术不但能筛选重组病毒，同时也能挑选特定的表型。克隆的挑选可根据：

1. 每个细胞产生病毒的数量。这可以用Southern杂交的方法，因为病毒DNA量与每个细胞的病毒含量有关。能产生高水平病毒量的克隆有利于生产高滴度的病毒储存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表达蛋白。

2. 每个细胞蛋白表达的水平。这可以用Western杂交或功能测定的方法。

请注意有些最佳克隆可能会较难培养。因此筛选方法的选择取决于用来观察生物学效应的蛋白表达水平和重组腺病毒的最终应用。

表4提供了选择最佳筛选方法的向导。报告基因、表达蛋白的抗体和功能测定的敏感性将影响操作方法的选择。得到最初结果的时间对方法的选择也很重要，但这一原则必须慎重考虑，因为如果最终目的是生产大量病毒，那么一个10倍量高产的克隆只需扩增1L即能达到原来10L的病毒量，这时使用快速筛选方法所节省的时间会在大量扩增过程中完全耗费掉。

表4：各种筛选方法的特性 

筛选方法 优点 缺点

Western杂交显示表达蛋白的完整性 显示插入基因的蛋白表达水平 

 可以用与其它蛋白有交叉反应的抗体，因为蛋白会在胶上得到分离 需要表达蛋白的抗体得到最终结果需两个星Southern杂交 或点杂交使用克隆基因作为探针,无须特殊试剂 通过信号强弱间接测定每个细胞内的病毒数量 需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间仅能检测克隆的基因 PCR迅速，使用扩增病毒的储存液只需1天时间 仅能检测克隆的基因且无法定量 ，可能需要优化克隆基因的PCR条件免疫测定相对快速，总共需要3天时间，显示插入基因的蛋白表达水平需要与细胞蛋白无交叉反应的特异性抗体

功能测定直接显示蛋白的完整性和功能 需从病毒储存液中额外扩增，整个流程需要一周时间对于大多数方法来说，信号密度与蛋白的表达水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的纯度有关。空斑总量中的阳性率提示克隆的纯度高低。比较不同克隆间的信号密度水平时克隆的纯度非常重要，也就是说必须保证所有筛选出来的空斑必须100%阳性。

5.5.2病毒空斑挑选和小量扩增 VKAo zOV P 

通过AdEasyTM系统纯化得到的细菌克隆而产生的病毒空斑应该几乎都是（95%）重组病毒。每个细菌克隆最好测定至少1~2个空斑的表型。

操作步骤

1. 从培养板上挑选6~12个空斑，标上圆圈。

2. 无菌条件下用200μL枪头挑出克隆并转入含0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。 

3. 37℃病毒24小时。

4. 铺一块每孔含1×105 QBI-293A细胞的24孔板。

5. 移去培养液，轻轻加入100μL步骤3中清洗的病毒（约103病毒颗粒），切勿将细胞吹起，十字型轻轻晃动3次，转入CO2孵箱37℃培养90分钟。

6. 加入DMEM5%，使总体积为1mL，轻轻混匀。

7. 37℃ CO2孵箱培养直至完全出现CPE，在此MOI值下一般需要5~10天。如果10天后还没出现CPE，说明此克隆的病毒量太低，需要进行第二轮扩增。

8. 为从细胞中释放病毒，在-20℃和37℃中充分冻融细胞3次。

9. 收集细胞，在15mL离心管中打碎。台式离心机上以最大转速离心10分钟，收集上清并储存于-80℃。这一冻存液中大约有5×107VP/mL。如步骤7中所述，如果在第一次扩增后CPE不完全，则进行第二轮扩增。由于QBI-293A细胞含有腺病毒基因组的E1区，因此E1区缺失的腺病毒与人染色体发生同源重组而产生有增殖能力的腺病毒（RCA）的机率很低。

发生这种回复突变的机率大约为1/107，这种腺病毒的增殖速度比重组腺病毒快。首轮扩增产生的腺病毒保存液是十分重要的，因为它含有RCA 的可能性最低。这种保存液必须节约使用，并保存好所有低代病毒，以便进行大量扩增，不可用已传过数代的病毒进行大量扩增。低代病毒DMEM5%溶液可在-80℃条件下保存数年。所以，保存好低代病毒可避免进行重复筛选和纯化病毒克隆的工作。

在这一期间可以选择适当的方法来筛选重组病毒，当所有病毒空斑100%为正确的重组病毒时可以认为这个克隆为纯的。如果此时病毒仍然不纯，则可以进行第二轮空斑纯化，然后再用适当方法进行筛选。

 

5.5.3 Western 杂交

以下内容提供了进行Western杂交的一般指导。按照本手册制备的初次病毒扩增保存液已足够用来检测大多数腺病毒蛋白，SDS-PAGE、抗体反应和检测系统的具体操作请参考标准实验手册。

1. 在5×105细胞/孔的24孔板中每孔加入500μL DMEM5%培养液，然后再每孔加入200μL初次病毒扩增保存液感染48小时。

2. 确证所有细胞均出现CPE，如果CPE不完全则再延长感染24小时。

3. 取出400μL转入1.5mL试管中，其余-80℃冻存。 

4. 800rpm离心5分钟，弃上清后用20μL PBS重悬细胞，用P20移液枪充分混匀重悬细胞。

5. 加入20μL 2 × Laemmli缓冲液（注意：对于某些蛋白和抗体，这一步使用不含巯基乙醇的缓冲液至关重要）。

6. 煮沸5分钟。

7. SDS-PAGE上样。

不同克隆抽提物中的蛋白含量变化很大，上样量勿过量。在显微镜下先测定每个样品的蛋白含量对于获得好的结果十分重要，每孔的蛋白上样量大约为5~10μg。

 

5.5.4 Souther杂交和点杂交

1． 六孔板中加入2×106 QBI-293A细胞，然后加入含500-10

5.5.5病毒裂解产物PCR

理论上讲，这是筛选重组病毒最快的方法，但是很难预料一对引物能否正常工作，因此常常需要优化PCR条件。如果把优化PCR条件的时间也计算在内，那么获得最终结果需要的时间可能和其它定量方法差不多。PCR反应可直接用初次扩增得到的病毒保存液进行（5.5.2，第9步）。一个25ul反应体积的标准PCR反应需要4ul病毒保存液（无需抽提），25pM引物和1单位Taq酶，取5-10ul进行电泳分析。标准的PCR过程请参考通用的分子生物学手册。如果PCR扩增无效，则反应前需象Souther杂交一样抽提DNA（Hirt法）。其实，每个克隆用酶切反应进行分析更为合适，因为尽管酶切和PCR需要相同的时间，但酶切分析更能确认重组病毒的序列结构。

 

5.5.6 免疫

这是最快的筛选方法。免疫测定可直接在培养孔进行，一天内即可完成。但这方法需要特异的抗体，而且无法定量。具体操作请参考相应的标准免疫测定方法。

1． 如5.2.1中所述，用初次扩增的病毒保存液感染细胞。 

2． 4%多聚甲醛固定感染的细胞20分钟，PBS洗2次，如果需要可用0.075%曲拉通/ PBS渗透，PBS洗2次以上，2%BSA阻断60分钟。

3． 加入一抗37℃培养60分钟。

4． PBS洗两次。

5． 加入标准的二抗（FITC，缄性磷酸酶，辣根过氧化物酶等）进行孵育。  

6． 用相应方法进行蛋白显色。

5.5.7 功能测定

有些蛋白的功能可直接进行测定。如果目的是进行蛋白表达，那么建议用评价蛋白功能的方法来筛选病毒，必须应用能准确评价蛋白质量的方法，操作应视需要进行相应调整。以下是分离含有完整蛋白的被感染细胞的一般方法：

1． 在每孔含5×105细胞的24孔板中，每孔加入700ul含200ul首次病毒扩增保存液（5.5.2，第9步）的DMEM5%，培养48小时。

2． 观察细胞直至完全出现CPE，如果CPE不完全，再延长感染24小时。

3． 取出400ul转入1.5ml离心管中，将剩余的300ul冻于-80℃。