病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增

  一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在QBI-293A细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法，按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011~3×1012。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000~10000，因此1L培养细胞可得到约5×1012病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3×108的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提（根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀）。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。

 

操作步骤：

1. 在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 QBI-293A细胞。

2. 取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。 

3. 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。 

4. 加入9ml DMEM5%。

5. 再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒（5.3）。   

如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定（5.8）。收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后按5.8进行病毒滴定。

 

6. -20℃/37℃冻融3次。

7. 转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。

8. 3个175cm2培养瓶中各加入107 QBI-293A细胞进行培养。

9. 将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培

养90分钟。此时MOI值约为25。

10. 加入DMEM5%至30ml。

11. 再培养48~72小时。此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。若需要，进行MOI测定（5.3）以估计病毒滴度。此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤（5.8）。600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，按5.8章中所述进行病毒滴定。

12． 移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。 S1 3ZdaHiJ 

13． 30瓶175 cm2培养瓶中每瓶各加入107 QBI-293A细胞。

14． 将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM5%混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃培养90分钟。此时MOI值约为25。

15． 加入DMEM5%至30ml/瓶。

16． 再培养48-72小时，此时约有3×1011~3×1012个病毒。若需要，进行MOI测定估计病毒滴度。如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM5%中。-20℃/37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM5%中3×1011~3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010~6×1011vp/ml。然后按5.8章中所述滴定病毒储存液，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。在109细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加RCA产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低RCA产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2代病毒产生第3代病毒。如果没有第2代病毒，那么必须用第1代病毒来产生新的第2代病毒。按这个原则进行扩增可使RCA水平尽可能低。如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取1-5mg蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。 

表5：腺病毒扩增

         第一代 第二代 第三代 第四代 21D c}GlEH 

每瓶细胞数 1×105 5×106 1×107 1×107

培养瓶大小 

（cm2）   75 175 175

培养瓶数 24孔板1孔 1 3 30   

感染来源 稀释的空斑 首次扩增后的病毒保存液 第二代病毒 第三代病毒

每瓶接种量 0.1 mL 0.5 mL或 n d 

2.5×107   1 mL 1.5 mL 

总培养体积 1 mL 10 mL 90 mL 900 mL 

MOI 0.01 5 25 25 A

滴度（VP/mL） 1×108~9 5×108~9 3.3×108~9 3.3×108~9 

总病毒量 1×108~9 5×109~10 3×1010~11 3×1011~12