猪细小病毒(Porcineparvoviurs)同义名：猪细小DNA病毒
猪细小病毒(PPV)是Mary和Mahnel于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，并认为是培养细胞内潜伏感染的病毒。随后相继从一些正常猪肾细胞培养物和感染猪瘟病毒的猪肾细胞中发现直径为22～23nm的病毒粒子，并认为与Kilham(1959)发现的大鼠细小病毒相似。通过核酸鉴定证明为DNA型。Cartwright等(1967)在对猪的不孕症和流产、死产的病原学研究中，从病料中分离出了猪细小病毒，从而首次证明了它的致病作用。通过血清学鉴定证实，所有上述分离毒株，包括从一些传代细胞系中分离的类似病毒均与PPV同属一型，尽管名称各异。从六十年代中期分离病毒和逐步明确其致病作用以来，已相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分到病毒或查出抗体。它在猪群中检出率甚高：如美国一些猪群的血清抗体阳性率达50%～80%，丹麦12%～42%，澳大利亚52%，英国19%～56%，德国54%。在日本，据估计约10%的猪流产是由本病毒引起的。我国已先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川和淅江等地分离到了PPV，血清学调查的阳性率为80%。
〖BT4〗1.形态和理化学特性 病毒外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴立体对称，衣壳由32个壳粒组成。核心含单股线状DNA，分子量为14×106,G＋C＝48%。DNA分子量约占整个病毒粒子分子量(53×106)的265%。病毒粒子在氯化铯中的浮密度为137～139g/cm3，沉淀系数为105S。〖KH4〗〖JZ〗〖HT5”SS〗图37-2 猪细小病毒的免疫〖WB〗电镜(横杠=100nm)〖DW〗——自杨盛华〖HT5SS〗 与多数细小病毒一样，PPV对加热具有强大的抵抗力。据Cartwright等的试验资料(1967)，当56℃30分钟加热处理时，无论病毒的传染性还是凝集红细胞的能力，都无明显改变。在70℃经2小时加热处理后，其感染力虽有所下降，但并不丧失。但80℃经5分钟加热即可使其失去活性。病毒对酸有较强的抵抗性，在pH3～9间稳定。 病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂有抵抗力。短时间的(如1小时)胰酶处理对病毒悬液感染性不仅没有影响，而且能提高其感染效价，这可能是由于胰酶使病毒粒子在悬液中进一步分散的缘故。 组织培养的病毒悬液或保存在pH9甘油缓冲盐水中的病毒，在－20℃和－70℃下，经一年以上的保存，无论其感染效价和血凝性都不减弱。
〖BT4〗2.血凝性PPV能凝集鼠、豚鼠、恒河猴、鸡、鹅和人O型红细胞。75℃以上加热处理后，病毒的血凝效价几乎完全消失。弱酸性到中性的介质适于血凝特性的保持。病毒感染的细胞培养物对红细胞的吸附作用很弱或没有。
〖BT4〗3.培养 PPV只能在来源于猪的细胞(包括原代猪肾、猪睾丸细胞和传代系PK15)和人的某些传代细胞(如Hela、KB、HEp2、Lu132等)中培养增殖，其中以原代猪肾细胞较为常用。 为了获得大量的病毒和使细胞出现明显的病变，要求在多数细胞处于旺盛的有丝分裂期进行病毒接种，不能象一般常规那样，待细胞形成单层后才接种病毒。为此，可于培养细胞同时，最迟也不超过24小时，就进行病毒接种。当接种时机适当，病毒接种量又大时，病毒大量迅速增殖，于2～5天出现细胞病变，7～8天达到收获程度。初期，细胞呈弥漫性颗粒样变化，继之发生圆缩和脱落，有时整个细胞层全部掉光。但接种时机过迟和接毒量太小时，往往看不到细胞病变，连续盲传后，致细胞病变作用可以增强。 在感染的猪肾细胞核内，最早可于接种后18小时发现A型包涵体(HE染色)，其中存在大量的病毒粒子(图37-3)。应用免疫荧光检测包涵体，发现有病毒抗原存在。
4.病原性 长期以来，人们怀疑PPV是猪繁殖障碍和胎儿畸形的病原之一。病毒可通过胎盘引起胎儿感染。Mengeling应用猪胚肾原代细胞培养物，从屠宰场宰杀的98头妊娠母猪中的3头母猪的胎儿分离到了病毒；又从82窝经子宫切开术取胎并被剥夺初乳的新生仔猪中的3窝，检出了高效价的血凝抑制抗体。此外，他还应用免疫荧光法从6个月木乃伊化的胎儿检出了病毒抗原，随后又用组织培养法分离出了病毒。据日本于1970～1974年的调查，本病毒引起的流产和死产多发于8～10月，且主要限于春、夏期间配种的初产母猪，因为经产猪多已发生感染免疫。流产可发生于全部妊娠期，但以妊娠中期前感染最为易发。 人工接种胎儿试验表明，随妊娠期的不同，感染结果有明显差别。如据Bachmann等的资料(1975)，于妊娠后35、48和55天感染时，胎儿经5～22天死亡，并呈现木乃伊化，能从其脏器分离出病毒。于妊娠后72、94和105天感染时，胎儿不仅存活并产生高滴度的抗体。成年猪人工感染不呈现临床症状，幼龄仔猪人工感染后可能发生倦怠、食欲不振、呕吐、下痢、跛行等症状。自然情况下，也常能从健康猪中分离到病毒。这些都表明存在无症状潜伏感染的猪。
5.流行病学 病毒能通过胎盘传染给胎儿，形成垂直传播，这已为很多实验所证实。Lucas等(1974)在被感染的公猪睾丸内发现了病毒，并证明能通过交配传染给母猪。病猪分泌液、排泄物及被其污染的器具均可引起传播。妊娠后期感染的胎儿虽出生后不见异常，但很可能成为传染源。由于本病毒常呈潜伏状态存在，故在进行正常组织培养时，往往出现这种病毒的污染。 血清学调查表明PPV感染在猪群中普遍存在，90%以上的老母猪和78%的小母猪呈PPV抗体阳性。部分6～8月龄母猪在第一次怀孕时对PPV无免疫力。在一项调查中，30%的小母猪和公猪的PPV血凝抑制抗体(HI)滴度低于1∶32，说明被动免疫已经降低。相反，98%的成年母猪的HI滴度高于1∶256，它们已产生了主动免疫。新生仔猪从血清阳性母猪的初乳中可获得较高水平的抗PPV抗体，但抗体滴度以后逐渐降低，到6～9月龄时，不能再检出抗体。此时，第一次怀孕的小母猪如果遭受PPV感染，最容易发生繁殖障碍。
6.免疫据Mayr和Cartwright等的试验资料，人工接种后，猪血清中于6～9天出现HI抗体，14～21天抗体滴度可达1024～5000倍。与接种猪密切接触的健康猪也呈现同样高的抗体滴度。由于70日龄以上胎儿感染时，在子宫内即可产生抗体，所以感染仔猪出生后，即可检出很高水平的抗体，这也是本病的一个特点。抗体水平随猪的年龄增长而逐渐下降。但由于本病毒与本属其它病毒一样具有潜伏感染的特性，位于局部的病毒，能不断地刺激机体产生免疫反应，所以低水平的抗体可持续很长时期。除血凝抑制抗体外，中和抗体、补结抗体也经常出现在循环血液中。
7.诊断主要靠分离病毒和血凝抑制试验。前者主要用于流产和死产胎儿，后者用于可疑病猪的诊断。
(1)病毒的分离和鉴定 通常采取可疑流产和死产胎儿的肾、肺、肝、脑、睾丸和胎盘等作为分离病毒的病料。从感染仔猪分离病毒时，以肠系膜淋巴结和肝脏的分离率最高。病料经研磨制成5～10倍乳剂，将离心后的上清接种于尚未形成单层的原代猪肾细胞或SK细胞系培养物内，也可与培养细胞同时接种。初次分离病毒时，一般不用PK15细胞系，因其不如前两种细胞敏感。标本中病毒浓度较高时，于接种后24～72小时出现细胞病变，当大部细胞出现病变和脱落时收获(如果细胞病变不明显，可进行盲传)。此时病毒浓度可达105～1065TCID50/02ml，血凝效价可达1∶1024。核内包涵体一般在接种后16～36小时出现。 用原代猪肾细胞培养分离病毒时，必须设不接种病料的空白对照培养，而且要盲传3代，只有当对照培养物正常，接种病料的培养瓶出现细胞病变时，才能判为病毒分离阳性，即病毒确系来自被检标本，而非来自分离培养病毒用的猪肾细胞。 据一些研究者的资料，直接应用病料组织，如肾、肺和睾丸等进行单层细胞培养，较接种其它易感细胞更容易成功，但病料组织一定要新鲜无菌，才能达到目的。 本病毒只有一个血清型，且与其它病毒不呈现交叉反应，所以应用已知标准免疫血清进行血清学反应，即可达到鉴定目的。其中以血凝抑制试验最常应用，其次为中和试验。简易快速的方法是在组织培养分离病毒过程中，应用免疫荧光抗体染色法直接检查单层细胞培养物，也可获得满意结果。 病毒培养物的血凝试验，在病毒鉴定上也有重要参考价值。它能凝集豚鼠、恒河猴、人O型、新生雏鸡、鹅、犬和小鼠的红细胞，不凝集猪、马、牛和兔的红细胞，实验室最常应用豚鼠红细胞。利用一段PPVDNA序列，用同位素或非同位素标记物标记，制成核酸探针，从病料中检测PPV是近年来发展的诊断方法，它明显提高了诊断的敏感性和特异性。
(2)特异性抗体的检验 ①血凝抑制试验：是最常用的血清学诊断法，可用试管或微量滴定板进行。血清先经56℃30分钟灭活，然后用50%豚鼠红细胞吸附除去血清中的非特异性凝集素，即可用于试验。首先以缓冲盐水对血清作倍比稀释(可从4倍开始到4096倍)，然后向每个稀释度的血清中加入等量的血凝抗原(含4个血凝单位)，混匀后室温感作1小时后，加入等量的05%～10%豚鼠红细胞悬液，混匀，放4℃下经4～6小时判定。同时设已知的阴、阳性血清对照。滴度1∶8以上判为阳性。感染猪能产生很高的血凝抑制抗体，最高可达4000倍以上。 ②中和试验：可用SK细胞系或猪肾继代细胞，采取血清稀释法，同时设已知阴、阳性血清对照。病毒滴度约100TCID50/01ml。向经过灭活的不同稀释度的血清管内，加入等量病毒悬液，混匀后放置2小时，取02ml分别接种3～4支培养管，在轻度振荡下吸附1小时(37℃)，然后补足维持液，放旋转鼓上或静止培养，经5～10天判定。
8.预防 后备母猪进入繁殖群，常常成为易感个体，并因感染而发生繁殖失败。所以将后备母猪群与经产母猪隔离能减少自然感染。应经常检查种公猪的感染状况，淘汰阳性公猪，因感染种公猪的精液带毒可通过交配而传播病毒。 ①自然感染免疫法：在存在本病的猪场，可以考虑采用自然感染免疫法，即在后备种猪群中放进一些血清阳性的经产母猪，或将后备母猪放在感染圈内饲养约1个月左右，使其受到自然感染而产生主动免疫力。此法的缺点是猪场长期遭受污染。 ②免疫接种：由于PPV血清型单一及其高免疫原性，使得疫苗接种成为控制PPV感染的一种行之有效的方法。于繁殖前给母猪接种疫苗是世界上大部分地区共用的方法。灭活疫苗、弱毒疫苗均可使用。
a.弱毒疫苗：PPV毒株NADL2在细胞培养上经过50多代已驯化成为一种活疫苗。将疫苗经口服、鼻内接种血清阴性的怀孕小母猪不引起胎儿感染，但子宫内接种对胎儿有致病性。与强毒株NADL8比较，1000倍的NADL2才能引起胎儿死亡。这种活疫苗在母猪繁殖前接种可产生免疫反应，保护强毒的攻击。Fujisaki等(1978)将有毒力的PPV在低温(30℃)猪肾细胞上传54代，产生的变异株称为HT，它接种猪后不产生病毒血症和排毒，但能诱导产生高滴度的抗体和较强的免疫力。将HT株再在猪肾细胞上培养并用紫外线照射后传代，获得了安全性和免疫原性更好的HTSKC株。 蒋玉雯等由广西初产母猪所产死胎的内脏分离获得1株自然弱毒株-N株。给1713头后备母猪在配种前进行田间试验，接种后HI抗体上升，免疫保护效果良好，母猪的产仔率、所产仔猪的成活率都明显提高。
b.灭活疫苗：细胞培养的病毒用β丙内酯、福尔马林、乙酰乙烯亚胺(AEI)以及二乙烯亚胺(BEI)灭活，加入佐剂如氢氧化铝胶可制成灭活疫苗。用β丙内酯灭活病毒，加氢氧化铝佐剂而制成的灭活疫苗可使猪产生HI抗体，至少持续4个月。第2针注射后在7天内产生强烈的回忆反应。疫苗在4℃保存6个月不降低免疫原性。Suzuki和Fujisaki(1976)用福尔马林灭活病毒接种动物，诱导产生了高滴度的抗体。灭活疫苗安全，但人们对其产生免疫反应的效果有争议，主要问题是青年猪低水平的母源抗体常常干扰灭活疫苗接种的效果。 潘雪珠等应用PPV的猪睾丸细胞培养物，以AEI灭活，制成油佐剂疫苗。两次注射的免疫应答反应可持续7个月以上。
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