霍华德霉菌直接镜检计数法

1适用范围

本方法适用于清汁、浊汁、水、浓缩果汁中霍华德霉菌直接镜检计数。

2设备和材料

2.1烧杯

2.2玻璃棒

2.3折光仪

2.4显微镜

2.5郝氏计测玻片

3 流程
取样→称样→稀释→调节视野→涂片→观察→记录→计算 
4步骤
4.1 检样制备
    取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.344～1.3460（即浓度为7.9～8.8％）。用糖度计或折光仪测定折光指数或浓度，如果折光指数过大或过小，须加水或样品，直至配成标准样液，才能进行检验。
4.2标准视野的调节
    霍德华霉菌计测用的显微镜，要求物镜放大倍数为90～125倍，其视野直径的实际长度为1.382mm，则该视野为标准视野。
    检查标准视野：将载玻片放在载物台上，配片置于目镜的光栏孔上，然后观察。标准视野要具备两个条件：载玻片上相距1.382mm的两条平行线与视野相切；配片（测微器）的大方格四边也与视野相切。如果发现上述两个条件，其中有一条不符合，须经校正后再使用。
4.3 涂片
4.3.1 检查玻片
    首先用擦镜纸或绸布沾酒精将载玻片和盖玻片擦净。检查是否擦干净，可将盖盖玻片置于载玻片的两条突肩上观察盖玻片与载玻片突肩的接触处是否产生牛顿环，如果没有产生牛顿环，表明没有擦净，必须重新擦，直至产生牛顿环，方可使用。
4.3.2 加样
    用滴管或玻棒取一大滴混合均匀的样液，均匀地摊布于载玻片中央的平坦面上，盖上盖玻片（盖玻片可直接盖上去，也可以从突肩边沿处吻合切入）。  如果发现样液涂布不均匀、有气泡、或样液流入沟内、从盖玻片与突肩处流出、盖玻片与载玻片的突肩处不产生牛顿环等，应弃去不用，重新制作。  涂好的制片，在计测室内，每个标准视野的样液体积为：
    πr²×0.1＝3.1416×（1.382/2）²×0.1＝0.15mm³
4.4 观察记录
4.4.1 观察视野数及分布
    对一般样品，每个涂片均检查50个视野（每一个样品至少应测25个视野，才能代表样品的各个部分。如果检查结果阳性视野低于30％，则检查25个视野即可；如果在30～40％之间，须检查50个视野；如果在40～50％之间，须检查100个视野；如果在50％以上或超过更多，则要继续检查，直至检查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止）。所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。
4.4.2 霉菌菌丝的鉴别 
    在同一视野内霉菌菌丝的特征是：
4.4.2.1 霉菌菌丝一般粗细均匀 
4.4.2.2 霉菌菌丝体内含有颗粒，具有一定的透明度 
4.4.2.3 有的霉菌菌丝有横隔 

4.4.2.4 有的霉菌菌丝有分支  
    当在标准视野下不能确认为霉菌菌丝时，可放大200倍或400倍上下调节视野，观察不同平面的菌丝。
4.4.3 记录结果
4.4.3.1 阳性视野与阴性视野的判断：在标准视野下，上下调节焦距发现有霉菌菌丝，其长度超过标准视野直径（1.382mm）的1/6（即一个小方格的边长）或三根菌丝总长度超过标准视野直径的1/6，这个视野称为阳性视野，否则称为阴性视野。有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“＋”表示；阴性视野用“－”表示之。
4.4.3.2 对初次学习霍德华霉菌计测法者，作记录前，先在记录纸上划出计测室上50视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“＋”或“－”的记录，或“－”以空格表示之。
这种记录方法，在计测过程中，可减少重复或遗漏计数的现象，也可以从记录表格上“＋”、“－”视野的分布，了解涂片是否均匀。
如果一个样品做两个片子，观察结果误差较大（超过6％），则另取样涂片，观察测定至误差＜6％时为止。  
5结果
5.1 计算
    霍德华霉菌计测数值，又称霉菌数，用百分比表示。其含义如下：
将0.15mm3标准样液，均匀地摊布成厚0.1mm，直径为1.382mm，其面积为1.5mm2的标准视野，在显微镜下检查。按100个视野数计算，其中发现有霉菌菌丝存在的视野数（即阳性视野数）。
 根据霉菌数含义，其计算公式如下：

 霉菌数（％）＝ ×100％    
 举例：记录的阳性视野数，片1为15，片2为16，则样品的霉菌数为：
 样品霉菌数（％）＝ ×1/2×100％＝31％

5.2 注意事项
    部颁标准为阳性视野不超过40％，在国际贸易中，合同上无要求时按部颁标准执行，合同上有要求时按合同执行;每抽取一罐样品制两个片子，每片观察50个视野，如果超过标准指标，应该继续制片，但片子数量不得少于3片即150个视野，如果计测结果相近时，可取其平均值;如对抽样结果有异议，应加倍抽样。全部合格，作为合格处理，其中有一罐不合格，该批作为不合格处理。
5.3 报告  
  作好计测记录，按记录计算计测结果并作报告。