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酱油—大肠菌群的测定—乳糖发酵法



录入时间:2009-8-27 14:25:10 来源:食品科技网

1  范围
本方法采用乳糖发酵法测定酱油中大肠菌群的 MPN值。
本方法适用于酱油中大肠菌群的测定,以 MPN/100mL报告其结果。
2  原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有
否污染肠道致病菌的可能。
3  试剂
3.1  溴甲酚紫溶液,0.4g/L 
3.2  乳糖胆盐发酵管:将蛋白胨20g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g及乳糖10g溶于1000 mL
水中,校正PH至 7.4,加入溴甲酚紫溶液25mL,混匀后分装每管 10mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌 15min。
3.3   双料乳糖胆盐发酵管:将蛋白胨 40g、猪胆盐(或牛、羊胆盐)10g 及乳糖 20g 溶于 1000 mL水中,校正PH至 7.4,加入溴甲酚紫溶液50mL,混匀后分装每管10mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min。
3.4   乳糖发酵管:将蛋白胨 20g 及乳糖 10g 溶于 1000 mL 水中,校正 PH 至 7.4,加入溴甲酚紫溶液 25mL,混匀后按检验要求分装 30 mL 、10mL、3 mL,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min。
3.5  EC肉汤:将胰蛋白胨 20g、3 号胆盐(或混合胆盐)1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾 4g、磷酸二氢钾 1.5g 及氯化钠 5g 混合,溶于 1000 mL 水中,溶解后分装有发酵倒管的试管中,并放入一个小倒管,121℃高压灭菌 15min,最终PH  为 6.9±0.2。
3.6   伊红美蓝琼脂平板: 将蛋白胨 10g、 磷酸氢二钾 2g 及琼脂 17g 溶解于蒸馏水中, 校正PH至 7.1 分装于烧瓶内, 121℃高压灭菌 15min, 临用时加入乳糖 10g 并加热溶化琼脂, 冷至 50~55℃,加入伊红美蓝溶液(6.5g/L)10 mL,摇匀,倾注平板。
3.7   革兰氏染色液:
3.7.1  结晶紫染色液:将1g 结晶紫溶解于 20 mL乙醇(950g/L)中,然后与80 mL 草酸铵溶液(10 g/L)混合均匀。
3.7.2  革兰氏碘液:将1g 碘与 2g 碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
3.7.3  沙黄复染液:将 0.25g 沙黄溶解于10 mL乙醇(950g/L)中, 然后用蒸馏水稀释至 100mL。 
4  仪器
4.1  温箱:36±1℃
4.2  恒温水浴:44.5±0.5℃
4.3  显微镜
5  操作步骤
5.1  样品处理:用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌,用石碳酸纱布盖好,再用灭菌开瓶器启开后进行检验。
5.2 检样稀释:以无菌操作,吸取酱油样品25 mL,加入装有 225mL灭菌蒸馏水的灭菌玻璃瓶内经充分振摇做成1:10 的均匀稀释液。
5.3乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量分别为 10mL 、1mL、0.1 mL稀释液,接
1种量在lmL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,lmI,及lmL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3 管,置36 士l℃温箱内,培养24士2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
5.4 分离培养
    将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置 36 士 1℃温箱内,培养18一24h,
然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
5.5  革兰氏染色试验
    将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1min,水洗,然后滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗,再滴加乙醇(950g/L)脱色约30s,(或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色 10s)水洗,最后滴加沙黄复染液复染 1min。水洗,待干,镜检。
革兰氏阳性菌呈紫色,阴性菌呈红色。
5.6   证实试验
     在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落 1~2 个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,
置 36 士 1℃温箱内培养 24 士 2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
5.7  报告
     根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每 100mL大肠菌群的 MPN值。

 

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