苯酚/氯仿溶液抽提法
1. 接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2. 离心，3000rpm，5min去上清
3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I （50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾 60ml，冰乙酸 11.5ml，水 28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。
6. 用120ul氯仿重复操作5。
7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
氯化锂抽提法
1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）
2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。去上清，尽量去干净。
3. 用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。
5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶 1μl ，连接酶缓冲液1μl ，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。
如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。
1试剂盒回收 (离心法)（详见说明书）
(1) 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)
(2) 根据凝胶的浓度,加DE-A 液
凝胶浓度 DE-A溶液体积
≤1.0% 3个凝胶体积
≤1.5% 4 个凝胶体积
≤2.0% 5 个凝胶体积
混匀后于75oC加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟).
(3) 加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;
(4) 吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
(5) 将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
(6) 将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有酒精，应保证瓶子密封。）
(7) 将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
(8) 将制备管置洁净的1.5 ml 离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1. 此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3. 2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60゜C,可提高回收效率。（重要）
5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。）
2 silica回收
1 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶, 用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2. 加入2-3倍体积的6M KI或NaI（避光4度保存）;
1. 65 oC温浴, 间断混合,直到凝胶熔化;
2. 加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀, 冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3. 5000rpm离心3分钟, 弃上清;
4. 加1ml预冷的NEW buffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上 洗盐2 分钟，间断混合;
5. 12000 rpm离心10s, 弃上清;
6. 重复6,7步骤1次;
7. 于50 oC烘箱烘干;
8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65 oC水浴15分钟,间断混匀;
9. 12000 rpm离心10 s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10. 跑胶检测回收效率.
注意事项
＊ 4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。
＊ NEW Buffer：（100ml）
1ml 5M Nacl, 1ml 1M pH7.5 This-HCl, 0.5ml 0.5M EDTA, 50ml 100% ETOH, 去离子水加至100ml。（-20度保存）
＊ Silica配法见：TIG January 1995 Vol.11 No. 1. An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purifyication.
用苯酚:氯仿抽提
1. 把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:氯仿,
2. 混匀,使之成为乳浊状;
3. 12000rpm离心, 5 分钟:
4. 用枪头把水相移到另一离心管中.
5. 加入等体积氯仿并重复2—4
6. 用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）
7. 12000rpm离心5分钟,弃液体
8. 70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，
9. 重复8一次，再12000rpm离心弃液体.
10. 50度烘干.
11. 去离子水溶解。
LiCl 抽提
1把样品至置于离心管中,加4/5体积10M LiCl
2 室温下静置1分钟
3 12000rpm离心5分钟
4把液体转移到另一离心管中
5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟
往下的步骤同于上面的8-12
1 将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。
2 加500μl水重悬浮，加入500μl 2% SDS, 混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。
3 加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。
4 加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，
6 加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA 沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。
7 用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。
8 烘干，溶解DNA沉淀。
1 将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr 左右至完全溶菌，
2 加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS），立即振荡混合完全，
3 打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃, 30min），然后于水浴中冷却至室温，
4 加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。
6 在上清液中加入1/10体积的3M NaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，
7用70%乙醇洗涤沉淀两次,
8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。
另：可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。
注：CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5 ul即可。也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。
所用的载体:pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor System
1. 酶连
(1) 体系 10ul
standard Reation Positive control Background control
2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligation 5ul 5ul 5ul
pGEM-T , pGEM-T Easy Vetor(50ng) 1ul 1ul 1ul
PCR product Xul --- ---
Control insert DNA --- 2ul ---
T4 DNA Ligase(3 weiss untis/ul) 1ul
Deionized water to a final volume of 10ul 10ul 10ul
(2).反应 4oC过夜
注 :PCR产物和载体的摩尔比为:
(ng of vector x kb size of insert)/(kb size of vector)*(insert: vector ration)=ng of insert
一般外源和载体的摩尔比例为3:1
T载体大小为 3bkb 50ng
2. 转化
(1) 取大肠杆菌感受态细胞100ul, 连接产物2-5 ul 加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.
(2) 42oC热激90秒.(不要摇动)
(3) 立即置冰上3-5分钟.
(4) 加1ml SOC培养基(室温)
(5) 37oC培养1.5小时(约150rpm摇动).
(6) 离心,去上清,余下的混匀涂皿(LB/抗生素/IPTG/X-Gal).
(7) 37oC培养16—24小时,挑白斑.
＊ 所用的培养基:
SOC培养基
胰蛋白胨 2g
酵母抽提物 0.5g
1M NaCl 1ml
1M KCl 0.25ml
2M Mg2+储液 1ml
2M 葡萄糖 1ml
* Mg2+储液
MgCl.6H2 O 20.33 g
MgSO4.7 H2 O 24.65g
加双蒸水到100ml,过滤灭菌
Southern Blot
转膜
1. DNA经酶切后，用Agarose凝胶电泳分离，切去多余的胶块并在右下角切去一角以便于识别方向，接着EB染色并拍照。（注意：TAE需新配，凝胶浓度视片段大小而定，一般为0.8%~1.0%，电压1~50v/cm）
2. 拍照后的凝胶先用无菌的去离子水轻轻摇晃，洗2次，5min/次。
3. 去嘌呤：在室温下，把凝胶置于盛有0.25M HCl的大平皿中轻轻摇动，直到溴酚蓝由蓝变黄（如果杂交的目标片段小于5kb，此步可省略），再用无菌水摇动洗5min 。
4. DNA变性：把凝胶放入盛有变性液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次，再用无菌水洗5min。
5. 中和：把凝胶放入盛有中和缓冲液的平皿中，轻轻摇动，洗2次，15min/次。
6. 把凝胶放入盛有20x SSC的平皿中，平衡10min。
7. 印迹：用一玻璃板横放于盛有20x SSC的搪瓷盘上作为桥，把一张用20x SSC浸润的3MM 的Whatman滤纸铺在玻璃板上，其两端放入瓷盘的20x SSC液体中，用玻璃棒赶尽气泡。把凝胶（点样孔面朝下）放在滤纸上，避免气泡产生，凝胶周围用胶板封住。剪一张比凝胶略大的带正电的尼龙膜平铺在凝胶上，避免气泡产生，（使凝胶湿润再放膜）。再在尼龙膜上放两张与尼龙膜大小一致的3MM滤纸，然后放一叠吸水纸在滤纸上，再在吸水纸上一平板，平板上放一500g的重物，印迹时间大于2h。
8. 紫外交联：取下重物及吸水纸拿出尼龙膜放在一滤纸上，与胶接触面朝上，放入紫外胶膜仪中胶联。
9. 用无菌水洗膜10min，如不立即杂交，自然烘干保存。
预杂交及杂交
1. 裁剪一张比尼龙膜稍大的杂交袋，把尼龙膜放入袋中，用封口机先封住三边，放入10ml预杂交液，赶尽气泡，封口。把杂交袋放入杂交筒中，预杂交时间大于4h,温度65゜C 。
2. 加探针：把探针先煮沸15min后立即放入冰中，至少10min ，然后把探针加入1ml预杂交液中，剪去杂交袋一角，除去绝大部分预杂交液，加入杂交液，除尽气泡封口，放入杂交筒中65゜C 杂交6~20h。
洗膜
1. 用2 x SSC, 0.1%SDS室温下轻轻摇动洗2 次，5min/次
2. 用0.5 x SSC, 0.1%SDS在 68゜C条件下洗膜 2 次，5min/次，轻轻摇动（可在杂交筒中进行）
Dig检测
1. 洗膜后，用washing buffer 摇动润洗 5min。
2. 用100ml Blocking solution 温育30min，轻轻摇动。
3. 用20ml Antibody solution 温育30min，轻轻摇动。
4. 用washing buffer 轻轻摇动洗2 次，每次15min。
5. 在20ml Detection buffer 中平衡 5min。
6. 把膜转到用铂纸包裹的盛有新配置的Colorsubtrate solution的平皿中显色。
7. 用PH 8.0 TE终止反应。
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