链霉菌实验操作3

不同公司不同的酶要求的反应体系与反应条件会有不同，PCR反应可参考该酶的产品说明上的反应体系与反应条件。

一般的反应体系如：

引物(50pmol/μl)	各1μl     反应终浓度:	各1pmol/μl
模板(约30ng/μl)	1μl	约30ng
Buffer(10´, 含Mg2+)	5μl	1´
dNTPs(10mM)	1μl	0.2μM
高温聚合酶(5U/μl)	0.2～1μl	1－5U
ddH2O
总体积	50μl

PCR反应参考程序：

――――――――――――――――时间

Step 1   预变性     95-96℃       3-8min

Step2    变性       94℃         50sec

Step3     复性       ＊          50sec

Step4     延伸       72℃        ＊

Step5    2、3、4步骤循环（25次左右）；

Step6     延伸        72℃        10 min

4℃结束反应（4度长时间保温对PCR仪有较大损伤，一般不超过1小时便及时取出，绝对不允许过夜保温）。

 

注：

                 引物应该用专门的软件（如Primer Premier）认真设计，注意两条引物的Tm值大致相等，GC含量较均一，引物自身以及之间不形成强的二级结构，特别是引物的3’ 端，引物不和模板其他位置形成强的配对（主要看引物3’端）。

                 MgCl2浓度依不同的模板和引物而定。MgCl2的浓度对PCR结果影响很大。

                 链霉菌的PCR因模板的GC含量高，可加DMSO（能降低复性温度）其浓度可在0~10%之间变化。

                 模板为环形质粒时若一次没有扩增出来，可以考虑先用酶将其切成线性再作。

                 对高GC含量的模板，预变性的时间也可适当延长，甚至先在沸水中煮5分种，然后迅速放入冰中。如果使用预变性温度高或时间长，一般要使用“热启动”，即在预变性后再加入酶，这样一是可以保护酶，二是可以避免低温时酶的非特异性扩增。

                 现在的PCR仪一般都有“热盖”装置，可以代替原来使用的矿物油，避免PCR过程中水份蒸发到管盖上。

                 复性温度依引物Tm值及引物与模板的匹配程度而定，提高复性温度可提高扩增的特异性，而当无扩增条带时，可适当降低复性温度。

                 延伸时间可根据扩增区域的长度确定，扩增区域越长，延伸时间越长。不同的聚合酶的延伸速度不一样，具体看说明书，一般高保真聚合酶平均每分钟延伸600bp，普通Taq酶每分钟延伸1kb。

                 根据不同需要使用不同的聚合酶，尤其当用于扩增表达的基因序列时，一定要使用高保真的酶，作普通的PCR验证时就可用普通Taq酶。以链霉菌或其他高GC含量的DNA作模板时，由于GC含量越高，模板和引物的二级结构越复杂，延伸和配对越难，PCR反应不好做，可以暂时（2003年7月－）用TaKaRa的La Taq酶作普通的PCR，保真度不敢保证，但扩增效果很好。酶的用量可参考说明书，并不是越多越好。

                 LA Taq酶的GC buffer往往能用于别的酶(如普通Taq酶或高保真酶probest)，使它们也能很容易地扩出高G+C的模板来。

 

 

注：1. 两条模板的量无需太大，因尽量保证1:1。

    2. 保证引物之间不会有干扰

    3. 四条引物的PCR重组比三条引物的 PCR桥重组容易操作。即分别设计引物对两个模板进行扩增，使扩增后两个模板有35-40bp的重叠序列，分别回收两个模板在只有两条外引物的条件下进行常规PCR.

 

1. 引物设计：每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45bp，设计的突变位点需位于引物中部。

2. PCR反应：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循环次数少，一般为12个循环。

  反应体系：

10x pyrobest Buffer                         5 ul

dNTP Mixture(10mM)                       1ul                   

模板DNA(5~50ng)                         1ul

primer 1 (125ng)                            1ul

primer 2 (125ng)                            1ul

pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul)    0.25ul

加无菌蒸馏水至                            50ul     

3. PCR产物沉淀纯化：加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20゜C冰箱）5min，离心弃上清，70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）

4. DpnI酶切：   Buffer                   2ul

                BSA（100╳）           0.2ul

                DNA                    x ul

                DpnI                    0.5ul               

                加无菌去离子水至              20ul

  30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 终止反应。

5. 将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

6. 测序验证