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链霉菌实验操作6



录入时间:2009-8-28 17:11:24 来源:食品科技网

六、蛋白质基本操作技术

SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色

(1)将干净的胶板装好,用琼脂糖胶(至少1%浓度)封边。
(2)配分离胶,配方如下:(1.5mm厚的胶需要10ml)
10%分离胶(5ml):去离子水1.25ml,30%丙烯酰胺1.7ml,1M This-HCl(pH=8.8)1.95ml,10% SDS 50ul,10%过硫酸胺100ul,TEMED 2ul。(倒胶前才加入TEMED催化剂)
(3)用去离子水密封液面,左右轻轻摇摆使液面水平(聚丙烯酰胺的聚合不能接触氧气,所以用水封液面,水还能使聚丙烯酰胺的上液面保持平整。)
(4)室温聚合或放温箱中加速聚合,倾斜胶板吸出水,倒浓缩胶(1.5mm厚的胶需要3ml)。浓缩胶配方如下:
浓缩胶1ml:去离子水0.68ml,1M This-HCl(pH=6.8)0.13ml,30%丙烯酰胺0.17ml,10% SDS 10ul,10%过硫酸胺10ul,TEMED 1ul。(倒胶前才加入TEMED催化剂)
(5)插上梳子,等胶凝固后,拔掉梳子,如果胶孔里有很多气泡,需要用滤纸剪成小条吸去气泡。
(6)加入电泳缓冲液点样电泳,蛋白在浓缩胶时可以用150V电压,在分离胶时可以用250V电压,注意观察蛋白的浓缩效果,如果浓缩效果不好说明电泳缓冲液或配胶时的缓冲液用的次数过多,或已经不能用了,电泳缓冲液可用4-5次。
(7)电泳完毕后用染色液染胶至少1小时,脱色2至5小时(根据胶的厚度),其间换脱色液2-3次,可用水继续脱色和短期保存胶,或制备干胶长期保存。
 
试剂:
30%丙烯酰胺:29g丙烯酰胺,1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺,温去离子水定容到100ml(请先在棕色瓶子上做好记号定容,丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺都有毒,要带手套和口罩操作,不要污染量桶)
Tris-Gly电泳缓冲液(5倍,1L):15.1g Tris,94g Glycine,pH8.3,50ml 10%SDS,去离子水定容。
10%过硫酸胺:0.5g过硫酸胺,去离子水定容到5ml。4度保存。(此物容易失活,最好每次少量配置。胶凝不了,凝的时间长或凝得不充分多半是它的问题。过硫酸胺在聚合反应过程中提供自由基。)
脱色液(0.5L):50ml冰醋酸,225ml甲醇,225ml去离子水。(甲醇有毒)
(或50ml冰醋酸,235ml 95%乙醇,215ml去离子水。)(防止挥发,密闭保存。)
染色液:0.25%(染色效果不好就加大)的考马斯亮蓝溶于脱色液中。
 

大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提(用于由IPTG诱导的表达体系):

可溶性蛋白的表达没有固定的方法,对不同的蛋白会有不同的方法,如果抽出的可溶性蛋白不多,可用基本培养基代替LB,用30或25度培养代替37度,IPTG(诱导物)的量也可减少,诱导时间也可变化。下面的方法仅供参考:
1.  将菌接种于5ml LB(含抗生素)培养基中过夜培养,
2.  将过夜培养物全部接种到200ml含抗生素的 MM培养基中,37度培养4-5小时,加IPTG至终浓度0.5mM(可变),37度培养13小时。
3.  将细胞培养物用20mM的冰冷的Tris-HCl(pH=7.5)浓缩10倍,
4.  在冰上用超声波处理(power lever为4-5,duty设为40-50%,60-120次脉冲,每30次脉冲后在冰中放30秒冷却),
5.  4度10000rpm离心10分钟,
6.  将上清通过0.45um的滤膜(细菌过滤器)
 
附:MM培养基(1L)
硫酸铵1g,磷酸氢二钾0.5g,7水硫酸镁0.2g,7水硫酸亚铁0.1g
 

链霉菌总蛋白抽提:

方法一:原生质体法
用作链霉菌原生质体的一般步骤作到用过滤器过滤那一步,后面的操作就和大肠杆菌一样。
方法二:液氮法
1.  将摇好或从平板(铺有玻璃纸)上刮下来的菌体放入已经由液氮预冷了的拈砵中,加液
氮,用瓷棒将菌体磨成粉状,其间可加一两次液氮。(摇的菌体需先离心去掉培养基)
2.  将粉末收集到冰冻过的瓶子中(可-70度保存)
3.  直接加pH为7.4(或其他)的20mM Tris-HCl到一定体积
用大肠杆菌的方法加上样液,煮菌体,上样。(加上样液之前后一定将菌体尽量打散,可防止菌体不能完全破裂,且加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。)
 

大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测(含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系):

诱导蛋白表达:
1.  取过夜培养物50ul-200ul接种于5ml含抗生素的Universal瓶中
2.  37度摇2小时左右
3.  取一定体积的菌液做阴性对照,其余的加IPTG至终浓度为0.2mM(可变)(4ml培养基加80mM的IPTG10ul)
4.  37度摇2小时左右
检测蛋白表达:
5.  取100ul(或更多)培养物,用pH值为7.4的20mM Tris-HCl(或PBS 7.4)浓缩10倍或5倍。(菌体多时也可不浓缩)
6.  加等体积的2倍上样液(Sampling Buffer),或1/9体积10倍上样液。(加上样液之前后最好将菌体尽量打散,可防止菌体不能完全破裂,还可加入1M的DTT至终浓度50mM防止加热时二硫键的形成。)
7.  100度煮2-4分钟
8.  12000rpm,离心1min(菌体破碎完全时也可不做)
9.  取上清点样做SDS-PAGE
 
部分试剂:
1.  蛋白上样buffer(2倍)(10ml):
SDS 0.2g,溴酚蓝0.0006g,1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml,glycerol 1.5ml。
2.  蛋白上样buffer(10倍)(10ml):
SDS 1g,1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml,溴酚蓝0.003g,glycerol 4ml。
3.1M DTT(二硫苏糖醇)
3.09g DTT溶于20ml 0.01mol/l 乙酸钠,过滤除菌,分装,-20度储存。
 

Western Blot

1.         SDS-PAGE
2.         将胶切成所需的大小放入转移缓冲液中15-60分钟。(胶在不同的缓冲液中会有不同的大小,这一步能让胶的大小达到平衡。0.7mm的胶只需平衡20分钟左右,1.5mm的胶需平衡40分钟)
3.         将电转夹板平放在桌面上(先垫一层保鲜膜),依次在夹板的一面放上海绵,滤纸,胶(塑料片),膜,滤纸,海绵,关闭夹板。(所有的东西都要先用转移缓冲液(transfer buffer)浸湿;胶和膜之间不能留有气泡;需要用洁净的玻璃棒从一侧开始把气泡赶走;塑料片放在胶的旁边;蛋白转移一般用硝酸纤维素膜,光的一面朝向胶;滤纸的大小和海绵差不多,膜的大小比胶稍微大一点)
4.         将电转夹板放入电转槽中,有胶的一面朝向负极,电转槽中可放入搅拌子,在电转时搅拌可是缓冲液离子和温度保持均一,电转应在4度(冰箱中)进行,可30V过夜电转或70V电转5小时。
5.         拆开电转夹板,将膜放入洁净的培养皿(7cm)中,用丽春红(Ponceau S)染液染色5分钟,室温,缓慢摇动。用去离子水脱色数秒钟,倾出去离子水,可以看见蛋白质红色的条带。(此步可不做,染色并不是很清楚。)
6.         用TBS润洗膜10分钟,脱去丽春红为止,如果没做第五步,则只需稍微润洗两三次即可,去掉SDS和电转缓冲液。
7.         倒掉所有的TBS,用封闭液(blocking solution)浸泡膜一小时,室温(或4度,过夜),轻轻摇动
8.         用TTBS将膜润洗两三次(不需停留)
9.         将膜泡入含一抗的封闭液中,室温,轻摇2小时
10.     将一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性,(含有终浓度为0.02%的叠氮化钠防腐)
11.     重复8
12.     用含二抗的封闭液孵育1小时,收集含二抗的封闭液同步骤10
13.     重复8
14.     加显色液NBT-BCIP(10ml),暗处显色,摇动,5分钟至数小时内可显色好。
 
试剂:
ponceau S Stain(丽春红染液):
1ml冰醋酸,0.5g Ponceau S,去离子水100ml
TBS:
150mM NaCl,25mM This-HCl (pH=7.4)
TTBS:
0.5% Tween-20 in TBS
封闭液(blocking buffer)(约2%):
2.5g脱脂奶粉 用TBS定容到100ml,电炉上加热(用大些的容器防止产生大量气泡),冷却,用玻棒刮去表面的油脂,再加热冷却数次,滤纸过滤,用去离子水定容到100ml。长期保存需加叠氮化钠至终浓度0.02%。
Transfer Buffer(电转缓冲液):
300ml甲醇,3.64g Tris Base,21.6g Glycine,去离子水定容到1.5L
 
注:
电转的容器需最后用去离子水漂洗。所有的操作都要戴手套,防止手上的油脂和蛋白污染膜,也避免SDS,甲醇等试剂沾到手上。用一个洗净了的培养皿和保鲜膜做杂交和洗膜、显色等操作。
硝酸纤维素膜使用浙江台州的,0.45nm孔径,130nm厚度
使用北京六一电泳仪器厂生产的电转槽(40B)。
二抗用AP偶联的羊抗小鼠或羊抗兔抗体,使用NBT/BCIP染色试剂盒进行显色(华美,NBS82112天源代理)
抗体的稀释比例请参照产品说明和经验。
 

 

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