食品和水中肠球菌检验方法第2 部分：滤膜法

 

1范围

SN /T 1933 的本部分规定了水和液体饮料中肠球菌检验滤膜法。
本部分适用于生活用水、生产加工用水、废水及茶饮料、碳酸饮料等液体饮料中肠球菌的检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过SN / T 1933 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB / T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
SN / T 0330出口食品中微生物学检验通则

3 方法提要

一定数量液体样品或样品稀释液通过滤膜时，细菌被截留在滤膜上。将滤膜置于选择性培养基上培养后，肠球菌菌落呈现特定颜色。经过肠球菌菌落确证实验后，计数并计算滤膜上阳性肠球菌菌落数，即可检验出样品中肠球菌数目。

4 术语、定义和缩略语

SN / T 1933 . 1 确立的术语、定义和缩略语适用于SN / T 1933 的本部分。

5 设备和材料

5 .1电子天平：感量为0.001g 。
5 . 2 恒温培养箱：41℃士0 .5℃，35℃士0.5℃，45℃士0.5℃

5 . 3 振荡器。
5 . 4 移液管：容量1mL ,10mL 。
5 . 5 培养皿：9x50 mm ，直径90 mm 。
5 . 6 玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器。
5 . 7 抽滤瓶。
5 . 8 真空泵。
5 . 9 滤膜：直径47mm ，微孔径0.45um 士0.02um 。

6 培养基和试剂

实验用水符合GB / T 6682 分析实验室用水规格和实验方法的要求。除另有规定外，试剂为分析纯。

6.1 mEI 琼脂（见第A . l 章）。
6 . 2 胆汁七叶苷琼脂（BEA 琼脂）（见第A . 2 章）。

6 . 3脑心浸液肉汤（见第A . 3 章）。

6 . 4含6 . 5 % NaCl 脑心浸液肉汤（见第A . 4 章）。

6 . 5脑心浸液琼脂（见第A . 5 章）。

6 . 6缓冲蛋白胨水（见第A . 6 章）。

7 样品制备

7 .1抽样数量及抽样方法
抽样数量及抽样方法按SN / T 0330 进行。
7 . 2 样品的贮存和运送
采样后应尽快进行检验，冷冻样品如不能立即进行检验，应置于-18 ℃ 保存。应冷藏保存的待检样品在运送实验室过程中应于l ℃ ~ 4 ℃ 保存。样品采集后8h 之内要完成检验。
7 . 3 制样
7 . 3 . 1 污染程度低的水及液体饮料可以直接进行检验。
7 . 3 . 2 污染严重的水及液体饮料可吸取25 mL 样品，加人225 mL 缓冲蛋白胨水中，充分混匀，制成l：10样品匀液。
7 . 3 . 3 以上样品制备可根据样品污染程度及检验需要，进一步制成10 倍递增的样品稀释液。

8 检验程序

水和液体饮料中肠球菌滤膜法检验程序见图l 。

样品原液或适当倍数稀释液

↓

样品过滤

↓

mEl 琼脂4l℃ 士0.5℃ 24h 士lh

↓

取带蓝色晕轮的菌落进行确证实验

↙                 ↙                ↘            ↘

                   革兰氏阳性球菌     BEA平板生长，  在BHIB中45℃生长    6.5%NaCl的BHIB

                                         水解七叶苷                           中35℃ 生长

↓

肠球菌阳性

↓

菌落计数及计算

↓

报告结果

图1 食品和水中肠球菌滤膜法的检验程序示意图

9 检验步骤与计数

9 .1培养基平板制备
制备mEI 琼脂培养基（见第A . 1 章）。
9 . 2 样品量的选择
根据样品污染情况，选择适宜稀释度的样液。样品加样量在1mL ~100 mL 之间按半对数间距选择（例如：加样100ml 、30ml、10ml、3ml)，以能在滤膜上生长出20 个~60 个菌落为宜。每个样品至少选择三个加样量进行过滤。
9 . 3 样品过滤
将灭过菌的过滤装置连接到抽滤瓶上，用无菌镊子夹取滤膜，将滤膜放至滤器底部。无菌吸取样液至滤器内，打开真空泵进行抽滤。当全部样液通过滤膜后，用20mL~30ml灭菌生理盐水轻洗滤器边缘至少两次。关闭真空泵，打开滤器，用无菌镊子移取滤膜。
9 . 4 接种与培养
将已滤过样液的滤膜紧贴在mEI琼脂表面上，防止滤膜与琼脂间产生气泡，如有气泡产生，重新放置滤膜。倒置平板于41℃ 士0.5℃ 培养24h 士lh 。
9 . 5 菌落形态观察
肠球菌在mEI 琼脂平板的滤膜上形成带有蓝色晕轮的菌落。
9 . 6 确证试验
9 . 6 . 1 用灭菌接种针从滤膜上至少挑取10 个带有蓝色晕轮的菌落（不必考虑菌落本身颜色，只要是带有蓝色晕轮的菌落即可）进行确证试验。菌落分别接种到BHIB 肉汤和BHIA 斜面，BHIB 肉汤置35℃士0.5℃ 培养24h士lh , BHIA 斜面置35℃士0.5℃ 培养48h士lh 。
9 . 6 . 2 BHIB 肉汤培养24h士lh 后，每管肉汤培养物分别接种到相应BEA 平板、BHIB 肉汤及含6.5％氯化钠的BHIB 肉汤中。BEA 平板及含6.5％氯化钠的BHIB 肉汤置35℃士0. 5℃培养48h士lh ; BHIB 肉汤置45℃士0.5℃培养48h士lh，观察细菌生长情况。
9 . 6 . 3 BHIA 斜面培养48h士lh后，从斜面上挑取菌落作革兰氏染色。
9 . 6 . 4 革兰氏染色镜检为革兰氏阳性球菌；在BEA 平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀）; BHIB 肉汤中45 ℃ 士0.5 ℃ 生长；并且在含6 . 5 ％氯化钠的BHIB 肉汤中35℃ 士0．5℃生长良好；具有以上特性的典型菌落可确证为肠球菌。
9 . 7 肠球菌的计数
对确证为肠球菌菌落的滤膜进行计数，生长有20 个~60 个肠球菌的滤膜为计数合适范围。

9 . 8 肠球菌菌数的计算
根据所使用的样品量，按照式（1)，计算每100 mL 样品中肠球菌菌落数。

肠球菌／100 ml =肠球菌菌落数x100 /[样品过滤体积（mL）x稀释倍数]

10 结果报告

肠球菌：CFU/100ml 。

附录A

（资料性附录）

培养基

A . 1 mEI 琼脂

A . 1 . 1 成分
蛋白胨10.0g
氯化钠15.0g
七叶苷1.0g
放线菌酮0.05g
叠氮化钠0.15g
酵母浸膏30.0g
β-D- 引哚葡糖苷0.75g
琼脂15.0g
蒸馏水100O.0ml
A . 1 . 2 制法
将以上各成分加热溶解，121 ℃ 高压灭菌15min ，在50 ℃ 水浴中冷却。在5 ml蒸馏水中加0.24g萘啶酮酸，滴加几滴0 .1 mol/L的氢氧化钠，配制萘啶酮酸溶液，将此溶液加人mEI琼脂中。再加人0 . 02g无菌氯化三苯四氮唑（TTC ) ，充分混匀。调节pH 值至7.1 士0.2 。
倾注约4 mL~6mL的mEI琼脂至9x50 mm 的平板，琼脂厚度约4mm ~5mm。平板冷藏备用。

A . 2 胆汁七叶苷琼脂

A . 2 . 1 成分
蛋白胨8.0g
胆汁盐20.0g
柠檬酸铁0.5g
七叶苷1.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000.0ml
A . 2 . 2 制法

将各成分加热溶解, 121 ℃ 高压灭菌15 min ，调节pH 值至7 . 1 士0 . 2 。冷至45℃~50 ℃ 倾注平板。

A . 3 脑心浸液肉汤（BHIB )

A . 3 . 1 成分

牛脑浸出粉10.0g

牛心浸出粉9 .0g

胰蛋白胨10.0g

葡萄糖2 .0g

氯化钠5 . 0g

磷酸氢二钠2 . 5g

蒸馏水1000.0ml

A . 3 . 2 制法
将各成分加人蒸馏水中，加热溶解，调节pH 至7 . 4 士0 . 2 ，分装，121 ℃ 高压灭菌15 min 。

A . 4 含6 . 5 ％氯化钠（NaCl）脑心浸液肉汤
A . 4 . 1 成分
除加人氯化钠（NaCl) ，其余成分与BHIB 肉汤相同。
A . 4 . 2 制法
每升BHIB 肉汤中加60.0g 氯化钠（NaCl)，其余制法与BHIB 肉汤相同。
A . 5 脑心浸液琼脂
A . 5 . 1 成分
除每升BHIB 肉汤加15 .0g 琼脂，其余成分与BHIB 肉汤相同。
A . 5 . 2 制法
称取52g BHIA 溶于1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，每管分装10 mL , 121 ℃ 高压灭菌15min ，制备成斜面，调节pH 至7.4士0.2 。
A . 6 缓冲蛋白胨水

A . 6 . 1 成分
蛋白胨10 . 0g
氯化钠5 . 0g
磷酸氢二钠9 . 0g
磷酸二氢钾1 . 5g
蒸馏水1000.0ml
A . 6 .2 制法
按上述成分配好后，调节pH 至7.2，每瓶分装225 ml , 121 ℃ 高压灭菌15min 。