苯并噻二唑检测方法

1．  分析目标化合物

苯并噻二唑、苯并酸（苯并〔1,2,3〕噻二唑－7－羧酸）

2．仪器设备

带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪及液相色谱—质谱仪。

3．试剂

除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
磷酸缓冲溶液(pH8)： 第1液：称取71.64g磷酸氢二钠十二水和物，加水溶解至1,000mL 。第2液：称取31.21g磷酸二氢钠二水和物，加水溶解至1,000mL。将473.5mL第1液与26.5mL第2液混和，加水至1,000mL。

4．标准品

苯并噻二唑：含苯并噻二唑99％以上，熔点为133℃。
苯并〔1,2,3〕噻二唑－7－羧酸(以下称”苯并酸”)： 含苯并酸99％以上，熔点为261℃～262℃。

5．试验溶液的制备

a 苯并噻二唑试验溶液
① 提取方法
(I) 将样品粉碎后，过420μm 标准网筛，称取其10.0g，加入20mL磷酸缓冲溶液(pH8)，放置2小时。
加入100mL丙酮，搅拌3分钟后，用涂布1cm 厚硅藻土的滤纸，抽滤至磨口减压浓缩器中。取出滤纸上的残留物，加入50mL丙酮和20mL磷酸缓冲溶液(pH8)，搅拌3分钟后，按上述同样操作，滤液合并于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约50mL。
加入50mL 10%氯化钠溶液，滴加约1mL 0.2mol／L 氢氧化钠溶液，调整pH7.5～8.5 ，将溶液转移至300mL分液漏斗中。用100mL乙醚：正己烷（1：1）混合溶液洗涤上述减压浓缩器的茄型瓶，合并洗涤液于分液漏斗中。用振荡器激烈振荡5 分钟后，静置，乙醚和正己烷层移入300mL三角瓶中。水层中加入50mL乙醚：正己烷（1：1）混合溶液，按上述同样操作，合并乙醚和正己烷层于上述三角瓶中。
(II) 加入适量的无水硫酸钠，不时振摇、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再用20mL乙醚：正己烷（1：1）混合溶液洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作2次。合并两次洗涤液于减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。
残留物中加入30mL正己烷，转移至100mL分液漏斗中。加入30mL正己烷饱和的乙腈，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，转移乙腈层于磨口减压浓缩器中。正己烷层中加入30mL正己烷饱和的乙腈，按上述同样操作，重复2次，合并乙腈层于减压浓缩器中，40℃以下除去乙腈。残留物中加入5mL乙醚：正己烷（3：17）混合溶液溶解。
② 净化方法
在内径15mm，长300mm 色谱管中，注入5g悬浮在正己烷中的柱色谱用合成硅酸镁，其上再加入约5g无水硫酸钠，放出正己烷至柱上端余留少量正己烷。柱中注入a 提取方法所得的溶液后，加入50ml乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，舍弃流出液。再加入150mL乙醚：正己烷（1：1）混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入乙腈：0.5％乙酸溶液的混合溶液溶解，准确至5mL，此为试验溶液。
b 苯并酸试验溶液
① 提取方法
按照a 苯并噻二唑试验溶液中① 提取方法中（I）进行操作所得的水层中，加入0.5mL磷酸，使之成酸性。加入50mL乙醚：正己烷(1：1)混合溶液，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙醚和正己烷层移入300mL三角瓶中。水层中加入50mL乙醚：正己烷(1：1)混合溶液，按上述同样操作，合并乙醚和正己烷层于上述三角瓶中。加入适量的无水硫酸钠，不时振荡、混合，放置15分钟后，过滤至磨口减压浓缩器中。再用20mL乙醚：正己烷(1：1)混合溶液洗涤三角瓶,以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作2次。合并2次洗涤液于减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入5mL乙酸乙酯：甲醇(4：1)混合溶液溶解。
② 净化方法
在内径15mm，长300mm色谱管中，注入5g悬浮在乙酸乙酯中的柱色谱用合成硅酸镁，其上再加入约5g无水硫酸钠，放出乙酸乙酯至柱上端余留少量乙酸乙酯。将① 提取方法中所得溶液注入柱中后，注入50mL乙酸乙酯：甲醇(4：1)混合溶液，舍弃流出液。再加入200mL乙酸乙酯：甲醇（7：3）混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙酸乙酯和甲醇。残留物中加入0.5％乙酸溶液：甲醇（3：1）混合溶液溶解，准确至2mL ，此为试验溶液。

6．操作方法

a 定性试验
按照下列操作条件进行试验。试验结果必须与同样操作条件下标准品的结果一致。
①苯并噻二唑的试验
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶 (粒径5μm)
柱： 内径4.6mm、长150mm 不锈钢管。
柱温： 40℃
检测器： 波长254nm
流动相： 乙腈：0.5％乙酸溶液(2：3)的混合溶液。调整流速使苯并噻二唑14～16分钟流出。
②苯并酸的试验
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒径5μm)。
柱： 内径4.6mm、长150mm 不锈钢管。
柱温： 40℃    
检测器：波长235nm
流动相：0.5％乙酸溶液：甲醇(3：1)混合溶液，调整流速使苯并酸24～26分钟流出。
b 定量试验
根据与a 定性试验相同的操作条件下所得试验结果，用峰高法或峰面积法定量，求出苯并噻二唑和苯并酸的含量，按照下式，求得含苯并酸的苯并噻二唑的含量。
苯并噻二唑(包括苯并酸)含量(mg/kg)＝A＋B×1.17
A：酸式苯并-S-甲基的含量(mg/kg)
B：酸式苯并酸的含量(mg/kg)
c 确证试验
在与a 定性试验相同的操作条件下，用液相色谱--质谱仪测定。试验结果必须与标准品的一致。此外，必要时用峰高法或峰面积法定进行量。

7．定量限

0.01 mg/kg

8．注意事項

分别对苯并噻二唑和苯并酸定量，将苯并酸含量乘以系数换算成苯并噻二唑的含量，其和为分析值。