动物源性食品中四环素、沙星类残留量的快速测定方法

一 范围
    本方法规定了动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定方法。 
    本方法适用于动物源性食品中四环素类、沙星类高效液相色谱的快速测定。

二 方法

    2.1  原理
    试样中的残留物经四环素类、沙星类快速检测前处理试剂盒处理，样液经四环素类专用层析柱净化、浓缩用高效液相色谱检测，外标法定量。
 
    2.2  试剂和材料
    除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
    2.2.1  乙腈：色谱纯。
    2.2.2  甲醇：色谱纯。 
    2.2.3  三乙胺（分析纯）
    2.2.4  磷酸（85%）（分析纯）
    2.2.5  磷酸氢二钠:优级纯。
    2.2.6  乙二胺四乙酸二钠。
    2.2.7  柠檬酸：分析纯。
    2.2.8  磷酸氢二钠溶液:0.2mol/L。称取28.41g磷酸氢二钠,用水水溶解,定容至1000mL。
    2.2.9  柠檬酸酸溶液:0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸,用水溶解,定溶至1000mL。
    2.2.10  Mcllvaine缓冲溶液:将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合。
    2.2.11  Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:0.1mol/L。称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625mLMclllvaine缓冲溶液中,使其溶解,摇匀。
    2.2.12  标准品: 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星纯度大于98 %。
    2.2.13  标准贮备溶液:分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星各10mg，用甲醇溶解并定溶于100 mL棕色容量瓶中，配制成100 µg/mL的标准贮备液，置于-20℃保存，有效期三个月。
    2.2.14  混合标准工作溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、单诺沙星、恩诺沙星均为10 µg/mL的混合标准溶液。0～4℃避光保存。
    2.2.15  四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒* ()。
    2.3  仪器和设备
    2.3.1  高效液相色谱仪：配紫外-可见光波长检测器。
    2.3.2  匀浆机。
    2.3.3  固相萃取机
    2.3.4  离心机：4000 r/min。
    2.3.5  调速多用振荡器。
    2.3.6  聚四氟乙烯离心管: 2.5 mL，50 mL，具塞。
    2 .4  样品制备
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入四环素、沙星类快速检测前处理试剂盒中的提取剂1*(液体20mL)，用调速多用振荡器150 rpm振荡3 min,，4000 r/min离心5 min，收集上清液；再加入提取剂2*(液体10ml) 用调速多用振荡器150 rpm振荡3 min,4000 r/min离心5 min，合并上清液；取一半上清液加入四环素专用层析柱中(使用前依次用5mL甲醇、5mL缓冲液（2.2.11）激活)挤干，用0.80mL甲醇洗脱,收集洗脱液,用0.2mL乙酸铵缓冲液至1.0mL。供仪器测定。
    2.5 测定
    2.5.1  液相色谱条件
    a) 色谱柱:   C18柱，250 mm×4 mm(i.d.),粒度5µm;
    b) 流动相:  0.05 mol/L磷酸/三乙胺缓冲液（pH2.4）+乙腈(80+20,V/V);
    c) 流速:     1.0mL/min;
    d) 柱温:     室温;
    e) 检测波长: 四环素类紫外检测器360 nm。沙星类 紫外检测器310nm；荧光检测器激发波长280nm，发射波长450nm。
     f) 进样量：50 uL。 
    2.5.2  标准工作曲线绘制
移取各移取四环素类、沙星类混和标准液，用流动相稀释成20 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL标准工作溶液。按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，标准工作曲线范围：20.0~500 ng/mL。  
    2.5.3 试样测定
   用微量进样器准确吸取试样溶液（3.4），按液相色谱条件（3.5.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。 
    2.6  结果计算
    按式（1）分别计算供试样品中的四环素类、沙星类残留量。 
                        
        ω=   2×ci×V/ m     　…… (1)
       ω－水产品中四环素、沙星类残留量，ug/kg；
       ci －标准曲线上查出试样溶液中四环素、沙星类标准工作溶液的浓度，（ug/L）；
       v－最终定容体积数，mL； 
       2－换算常数； 
       m－供试试料样品重量，g。
     本方法分别计算四环素类、沙星类结果。 
     2.7  检测限
     本方法土霉素、四环素检测限为20ug/kg；金霉素、强力霉素的检测限为50ug/kg，沙星类为：5ug/kg 
     2.8  回收率
     本方法土霉素、四环素、金霉素、强力霉素回收率为:75%～85%；沙星类回收率为：75%～85%

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