苄青霉素检测方法

1．分析目标化合物

苄青霉素

2、试剂

    除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
    继代保存用培养基：由酪蛋白氨基酸、肉汤、氯化钠、琼脂等组成的培养基。
    检査用平板：在1000mL加温溶解后保持55℃的试验用培养基中加入5mL试验菌液，混合后，注入8mL于内径85mm培养皿中，水平保持至凝固。
    试验菌液：将继代培养基中继代培养的Bacillus stearothermophilus var.calidolactisC―953菌株接种到增殖用培养基中，在55℃培养6小时，作为试验菌液。
    试验用培养基：由肉牛心汤、胨、氯化钠、琼脂等组成。
    増殖用培养基：由酵母膏，トリプトン，葡萄糖等组成。
    圆盘：使用直径10mm，厚1.5mm 的牛津杯。
    磷酸缓冲液（pH6.0）：将7.0g磷酸二氢钾溶解在500mL水中，6.0g磷酸氢二钠溶解在500mL水中，将二份溶液混合。

3．标准品

苄青霉素钠：含苄青霉素1,650 単位／mg 以上，熔点为129℃～130℃。

4．试验溶液的制备

a  提取方法
①肌肉、肝脏和肾脏：
    肌肉：尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5. 0g。
    肝脏和肾脏：搅碎混合均匀后，称取其5. 00g。
    加入30mL水，搅拌后，5mL 0.17mol／L 硫酸和5mL 5％钨酸钠溶液，用振荡器激烈振荡5分钟，以每分钟3500转离心分离5分钟后，水层抽滤。沈淀中加入20mL水，用振荡器激烈振荡5分钟后，按上述同样操作离心分离，水层抽滤。合并两滤液，加入8 mL 25%氯化钠溶液。
②奶
    称取25.0g样品，加入25mL水和5mL飽和乙二胺四乙酸二钠溶液，用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3500转离心分离5分钟，水层抽滤。滤液中加入6mL 25%氯化钠溶液。
b 净化方法
    在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱（500mg）中，顺次注入10mL乙腈、10mL水和5mL 2%氯化钠溶液，弃去流出液。柱中注入a 提取方法所得的溶液后，顺次注入10mL 2%氯化钠溶液和10mL水，弃去流出液。注入5mL乙腈：水（4：1）混合溶液，流出液中加入10mL乙腈：水（4：1）混合溶液，此为试验溶液。

5、操作方法

a 定量试验
    取5mL试验溶液于磨口减压浓缩器中，在40℃以下除去乙腈和水，残留物中加入1mL磷酸缓冲液（Ph6.0）溶解。将此溶液它吸入圆盘上，在55℃培养17小时，与标准品抑菌圈直径比较，进行定量。
b 确证试验
    在玻璃板上涂布0.1mm厚的薄层色谱用微晶纤维素，用作薄层板。取5mL试验溶液于磨口减压浓缩器中的，在40℃以下除去乙腈和水，残留物中加入1.0mL丙酮：水 (1：1) 混合溶液溶解。将4µl溶液点在薄层板上，用丙酮：水：1－戊醇 (1：3：4) 混合溶液作为展开溶剂，根据上升法展开100mm后，风干。在薄层板上生成薄层，放入四方型培养皿中。在1,000mL经加温溶解后保持55℃的试验用培养基中加入5mL试验菌液的混合液分别注入2mm的厚薄层板上，保持水平凝固。放置1小时后，在55℃培养17小时，与标准品的抑菌圈的Rf 值进行比較。

6．定量界

肌肉、肝脏和肾脏：0.005mg/kg，奶：0.001mg/kg

7．注意事项

（1） 标准溶液的配制
①将标准品溶解在磷酸缓冲液（pH6.0）作为标准原液（苄青霉素1,667,000单位／l，1,000mg／L）。本标准原液保存在－20℃，1年内稳定。
②用磷酸缓冲液（pH 6.0）将标准原液递减稀释，作为定量试验用标准溶液。
③ 用50％丙酮溶液将标准原液递减稀释，作为确证试验（薄层色谱法）用标准溶液。