草胺磷检测方法

1．分析目标化合物

    草胺磷、草胺磷铵盐、N－乙酰基草胺磷、3－甲基亚膦丙酸

2．仪器设备

    谷类、豆类、种子类和甜菜: 带火焰光度检测器（磷干涉片，波长526nm）的气相色谱仪和气相色谱-质谱仪。
    水果、除甜菜以外的蔬菜和末茶: 带碱热离子检测器、火焰光度检测器（磷干涉片，波长526nm）或高灵敏度氮磷检测器的气相色谱仪和气相色谱-质谱仪。

3．试剂

    除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
    柱色谱用硅胶：将柱色谱用硅胶(粒径63～200μm)在130℃加热12小时后，置于干燥器中冷却。加入5％的水。

4．标准品

    草胺磷：含草胺磷99％以上，熔点为215℃。 
    3-甲基亚膦丙酸：含3-甲基亚膦丙酸99％以上。

5．试验溶液的制备

a 谷类、豆类、种子类和甜菜
① 提取方法
    谷类、豆类、种子类：将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其10.0g，加入70mL水，搅拌3分钟后，加入水，准确至150mL，充分振荡混匀后，静置。移取20mL水层于100mL分液漏斗。
    甜菜：准确称取约1kg样品，必要时定量加入适量水，搅碎混合均匀后，称取相当于20.0g样品的量。加入水70mL，搅拌3分钟后，加入水，准确至150mL，充分振荡混匀后，静置。移取20mL水层于100mL分液漏斗。
    加入30mL乙醚，缓慢振摇1分钟混匀后，静置。舍弃乙醚层。水层中加入30mL乙醚，充分振摇1分钟混匀后，静置。取15mL水层，加入1mL饱和乙酸铅溶液，不时振荡、混合，放置5分钟后，以每分钟3000转离心分离约5分钟，收集上清液。
② 净化方法
    苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱(265mg)下接苯磺酰基丙基甲硅烷基化硅胶小柱（500mg），下面再接三甲胺基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(1000mg),注入10mL乙腈, 舍去流出液。再注入10mL水，舍去流出液。柱中注入①提取方法所得上清液及10mL水，舍去流出液。将苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱(265mg)及苯磺酰基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(500mg)拆离，在三甲胺基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(1000mg)中注入10mL乙酸：水(1：1)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，50℃以下除去乙酸和水。
③ 衍生化
    在②净化方法所得的残留物中加入0.2mL乙酸，0.8mL原乙酸三甲酯溶解，塞紧，在100℃加热2小时后，冷却，氮气气流下吹干。残留物中加入丙酮溶解，准确至0.5mL，此为试验溶液。
b 水果、除甜菜以外的蔬菜和茶：
①    草胺磷试验溶液:
（I） 提取方法
    水果和除甜菜以外的蔬菜:准确称取约1kg样品，必要时定量加入适量水，搅碎混合均匀后，称取相当于20.0g样品的量。加入50mL二氯甲烷和150mL水，用振荡器激烈振荡30分钟后, 以每分钟3000转离心分离约5分钟后，上清液移入300mL三角瓶中。沉淀中加入50mL水，充分振荡混匀后，按上述同样条件离心分离，上清液移入上述三角瓶中。过滤，滤液中加水至500mL。
    末茶：称取5.00g样品，加入100mL水，用振荡器激烈振荡30分钟后, 以每分钟3000转离心分离约5分钟后，上清液移入300mL三角瓶中。沉淀中加入50mL水，充分振荡混匀后，按上述同样条件离心分离，上清液移入上述三角瓶中。加入4mL饱和乙酸铅溶液，不时振荡、混合，放置5分钟后，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸抽滤于1000mL茄型瓶中。再用50mL水洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物。合并洗涤液于上述茄型瓶中。将其移入1,000mL分液漏斗，加入100mL二氯甲烷，缓慢振摇混合1分钟后，静置，弃去二氯甲烷层。水层中加入100mL二氯甲烷，与上述同样操作，弃去二氯甲烷层。水层中加入100mL乙酸乙酯，缓慢振摇混合1分钟后，静置，收集水层，加水至500mL。
    末茶以外的茶：将10.0g样品浸泡在600mL 100℃水中，室温下放置5分钟后，过滤，移取300mL冷却后的滤液于500mL三角瓶中，加入4mL饱和乙酸铅溶液，不时振荡、混合，放置5分钟后，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸抽滤于1000mL茄型瓶中。再用50mL水洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物。合并洗涤液于上述茄型瓶中。将其移入1,000mL分液漏斗，加入100mL二氯甲烷，缓慢振摇混合1分钟后，静置，舍弃二氯甲烷层。水层中加入100mL二氯甲烷，与上述同样操作，舍弃二氯甲烷层。水层中加入100mL乙酸乙酯，缓慢振摇混合1分钟后，静置，收集水层，加水至500mL。
（II）衍生化
    在内径15mm、长300mm色谱管中注入20mL悬浮在水中的強碱性阴离子交換樹脂(粒径149～297μm)，放出水至柱上端留有少量的水。柱中注入40mL 1mol／L氢氧化钠溶液，注入水直至流出液的pH为8～9，舍去流出液。再注入40mL乙酸：水(1：9)混合溶液，注入水直至流出液的pH为5，舍去流出液。继续注入80mL乙酸：水(1：1)混合溶液，接着注入100mL水，舍去流出液。柱中注入（I）提取方法所得的溶液，舍去流出液。再注入200mL乙酸：水(1：9)混合溶液，舍去最初的50mL流出液，收集其后的150mL流出液于磨口减压浓缩器中，在50℃除去乙酸和水。残留物中加入1mL乙酸，再加入4mL原乙酸三甲酯，在100℃加热2小时。冷却后移入磨口减压浓缩器中，在40℃以下浓缩至约1mL，在室温下用氮气进一步吹干。残留物中加入10mL丙酮溶解。
（III）净化方法
    在内径10mm，长300mm色谱管中注入3g悬浮在丙酮中的柱色谱用硅胶，放出丙酮至柱上端留有少量的丙酮。柱中注入（II） 衍生化所得的溶液后，注入70mL丙酮，舍去流出液。再注入80mL丙酮：水(19：1)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去丙酮和水。残留物中加入乙酸乙酯溶解，准确至2mL，此为草胺磷试验溶液。
②    3－甲基亚膦丙酸试验溶液
（I）提取方法
    使用①草胺磷试验溶液的（I）提取方法。
（II）甲基化
    在内径15mm、长300mm色谱管中注入20mL悬浮在水中的強碱性阴离子交换树脂(粒径149～297μm)，放出水至柱上端留有少量的水。柱中注入40mL 1mol／L氢氧化钠溶液，注入水直至流出液的pH为8～9，舍去流出液。再注入40mL乙酸：水(1：9)混合溶液，再注入水直至流出液的pH为5，舍去流出液。继续注入80ml乙酸：水(1：1)混合溶液，再注入100mL水，舍去流出液。柱中注入（I）提取方法所得的溶液，舍去流出液。再注入200mL乙酸：水(1：9)混合溶液，进一步注入50mL乙酸：水(3：7)混合溶液，舍去流出液。继续注入150mL乙酸：水(1：1)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，在50℃除去乙酸和水。残留物中加入1mL乙酸，再加入4mL原乙酸三甲酯，在100℃加热2小时。冷却后移入减压浓缩器中，在40℃以浓缩至约1mL，在室温下用氮气进一步吹干。残留物中加入10mL丙酮溶解。
（III）净化方法
    在内径10mm，长300mm色谱管中注入3g悬浮在丙酮中的柱色谱用硅胶，放出丙酮至柱上端留有少量的丙酮，柱中注入（II）甲基化法所得的溶液后，注入100mL丙酮，舍去最初的20mL流出液，收集其后的80mL流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去丙酮。残留物中加入乙酸乙酯溶解。准确至4mL，此为3－甲基亚膦丙酸的试验溶液。

6．操作方法

a 谷类、豆类、种子类和甜菜
① 定性试验
    按下列操作条件进行试验，试验结果必须与用草胺磷和3－甲基亚膦丙酸的标准品按照5．试验溶液的制备中a 谷类、豆类、种子类和甜菜③衍生化相同操作所得的结果一致。
    操作条件
    柱：内径0.25mm、长30m石英毛细管，涂布0.25μm厚气相色谱仪用50%的苯基－甲基硅酮，老化。
    柱温：在100℃保持1分钟，此后每分钟升温10℃。到达260℃后，保持3分钟. 
    进样器溫度：250℃
    进样方法： 不分流
    检测器温度：270℃
    气体流量：以氦气作载气，调节流速使2－乙酰胺基－4－［甲氧基(甲基)亚膦基］丙酸酯约14分钟流出。调节空气和氢气流量至适当条件。
②定量实验
    根据与①定性试验相同的试验条件所得的试验结果，用峰高法或峰面积法分别对草胺磷（包括N－乙酰草胺磷）和3－甲基亚膦丙酸进行定量，求得草胺磷（包括N－乙酰草胺磷）和3－甲基亚膦丙酸的含量。按下式求得包括N－乙酰草胺磷和3－甲基亚膦丙酸的草胺磷含量。
    草胺磷（包括N－乙酰草胺磷和3－甲基亚膦丙酸）的含量(mg/kg)＝A＋B×1.30
    A：草胺磷（包括N－乙酰草胺磷）的含量(mg/kg) 
    B：3－甲基亚膦丙酸的含量(mg/kg)
③ 确证试验
    按照与①用与定性试验相同的试验条件，用气相色谱-质谱仪测定。试验结果必须与标准品按5．试验溶液的制备中 a 谷类、豆类、种子类和甜菜 ③ 衍生化相同操作所得的结果一致。必要时，用峰高法或峰面积法进行定量。
④标准曲线
    将草胺磷和3－甲基亚膦丙酸的标准溶液按照与5．试验溶液的制备中a 谷类、豆类、种子类和甜菜②净化方法和③衍生化相同的操作配成绘制标准曲线用的标准溶液。
b 水果、除甜菜以外的蔬菜和茶
① 定性试验
    按照a 谷类、豆类、种子类和甜菜中①定性试验相同的操作条件进行试验。试验结果必须与分别用草胺磷标准品按照5．试验溶液的制备中，水果、除甜菜以外的蔬菜和茶 ①草胺磷试验溶液的（II）衍生化和（III）净化方法相同的操作所得结果和用3－甲基亚膦丙酸的标准品按照5．试验溶液的制备中，水果、除甜菜以外的蔬菜和茶②3－甲基亚膦丙酸试验溶液（II）甲基化和（III）净化方法相同的操作所的结果一致。
②定量实验
    根据与①定性试验相同试验条件所得的试验结果，峰高法或峰面积法定量，分别求得草胺磷和3－甲基亚膦丙酸的含量。按下式求得含3－甲基亚膦丙酸的草胺磷含量。
    草胺磷（包括3－甲基亚膦丙酸）的含量(mg/kg)＝A＋B×1.30
    A：草胺磷的含量(mg/kg)
    B：3－甲基亚膦丙酸的含量(mg/kg)
③确证试验
    按照与①定性试验相同的试验条件，用气相色谱-质谱仪测定。试验结果必须与分别用草胺磷标准品按照5．试验溶液的制备中，水果、除甜菜以外的蔬菜和茶 ①草胺磷试验溶液的（II）衍生化和（III）净化方法相同的操作所得结果和用3－甲基亚膦丙酸的标准品按照5．试验溶液的制备中，水果、除甜菜以外的蔬菜和茶 ②3－甲基亚膦丙酸试验溶液（II）甲基化和（III）净化方法相同的操作所的结果一致。另外，必要时，用峰高法或峰面积法进行定量。

7．定量限

0.01 mg/kg（谷类、豆类、种子类、甜菜：0.05 mg/kg）。

8．注意事项

1） 分析值
    谷类、豆类、种子类和甜菜：分别对草胺磷（包括N－乙酰草胺磷）和3－甲基亚膦丙酸进行定量，将3－甲基亚膦丙酸含量乘以系数换算成草胺磷的含量，它们的和为分析值。
其它农产品：分别对草胺磷和3－甲基亚膦丙酸进行定量，将3－甲基亚膦丙酸的含量乘以系数换算成草胺磷含量，它们的和为分析值。
2） 测定谷类、豆类、种子类和甜菜时，希望用粒径为120μm的苯磺酰基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(500mg)；另外，用火焰光度检测器作为气相色谱仪检测器时，尽可能使用内径0.53mm，长30m，膜厚1.0μm 的柱子。