苯硫氨酯、奥芬达唑和苯硫苯咪唑检测方法

 氢氧化钠溶液
二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）：在内径 12～13 mm聚乙烯管中装填200mg二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分离特性的物质。
七氟丁酸： 七氟正丁酸
苯硫氨酯标准品：含苯硫氨酯99%以上，熔点为129℃～130℃。
苯硫苯咪唑标准品：含苯硫苯咪唑98%以上，熔点为233℃（分解）。

4．试验溶液的配制

1) 提取方法
称取5.0g搅碎混合均匀的样品，加入30mL乙腈、20mL乙腈饱和正己烷和10g无水硫酸钠均质后，以每分钟3,000转离心分离5分钟。乙腈层和正己烷层移入分液漏斗中，收集乙腈层。正己烷层加入离心分离的残留物中，再加入20mL乙腈，激烈振荡混合后，以每分钟3,000转离心分离5分钟。舍弃正己烷层，将乙腈层合并于前面的乙腈层中，加入10 mL正丙醇，40℃以下浓缩，除去溶剂。
2) 砜化
将1)所得的残留物溶解于0.5 mL无水乙酸后，加入0.5 mL过氧化氢混合，室温下放置30分钟。加入5 mL 1 mol/L 亚硫酸钠溶液混合，室温下放置10分钟后，加入10 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液。
3) 净化方法
在二乙烯基苯基－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）中顺次注入10m L甲醇、10mL水，舍弃流出液。柱中注入2)所得的溶液后，注入10mL水，舍弃流出液。注入10mL甲醇，溶出液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入1 mL甲醇溶解，作为试验溶液。

5．标准曲线的制作

苯硫氨酯试验时，将苯硫氨酯标准品配制成 0.05～50 mg/L 的甲醇溶液数点。奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验时，将苯硫苯咪唑标准品配制成0.05～50 mg/L 的甲醇溶液数点。将1 mL各标准品的甲醇溶液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物按照与4．试验溶液的制备中2)砜化和3)净化方法相同操作，分别注入HPLC 中，用峰高法或峰面积法绘制成标准曲线。

6．定量试验

注入试验溶液于HPLC中，按照5．的标准曲线分别求得苯硫氨酯和苯硫苯咪唑的含量，按下式求得奥芬达唑砜的含量。
奥芬达唑砜的含量＝（苯硫氨酯的含量× 0.74）＋（苯硫苯咪唑的含量× 1.11）

7．测定条件

1) 苯硫氨酯试验
① HPLC
检测器： UV 或DAD（波长 280 nm 附近的最大波长）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径 2～5 µm），内径2.0～6.0 mm，长100～250 mm。
柱温： 40℃
流动相： 乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液
保留时间标准： 7～10 分钟
② LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径 2～5 µm），内径2.0～6.0 mm，长100～250 mm。
柱温：40℃
流动相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液。
主离子 ( m/z)： ESI+ 479
保留时间标准： 7～10 分钟
2) 奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验
① HPLC
检测器： UV 或DAD（波长 290 nm附近的最大波长）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径 2～5 µm），内径2.0～6.0 mm，长100～250 mm。
柱温： 40℃
流动相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
② LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径 2～5 µm），内径2.0～6.0 mm，长100～250 mm。
柱温： 40℃
流动相：乙腈：0.005 mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
主离子 ( m/z)： ESI+ 332
保留时间标准： 7～10 分钟

8．定量限

0.01 mg/kg（奥芬达唑，奥芬达唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑中分别以奥芬达唑砜计）

9．注意事项

1)检测方法概述
本方法用乙腈从样品中提取奥芬达唑，奥芬达唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑，乙腈／正己烷分配脱脂后，用无水乙酸和30%过氧化氢将苯硫氨酯氧化成砜体、苯硫苯咪唑和奥芬达唑氧化为奥芬达唑砜，HPLC(UV 或DAD)分别测定，LC/MS确证。
2) 注意点
① 因无水乙酸、30%过氧化氢、亚硫酸钠的反应性高，操作中要小心。此外，因这些试剂经常容易变化，保管时要小心。
② 对于砜化，加入1 mol/L 亚硫酸钠溶液和1 mol/L 氢氧化钠溶液时，因激烈发热要小心。
③ 确认砜化结束，根据需要用HPLC和LC/MS测定奥芬达唑，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑。
作为各测定条件的例子：使用内径 3.0 mm，长150 mm 的柱时，
奥芬达唑：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:4）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV 测定波长：290 nm，MS 测定离子： ESI+ 316 ( m/z)，保留时间： 8 分钟。
苯硫氨酯：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:1）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV测定波长：280 nm，MS测定离子： ESI+ 447 ( m/z)，保留时间：约11 分钟。
苯硫苯咪唑：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（2:3）的混合溶液，流速：0.4 mL/min，UV测定波长：290 nm，MS 测定离子： ESI+ 300 ( m/z)，保留时间：约5分钟。
其他的测定条件按照7．测定条件的进行。
④ 在二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200 mg）中注入砜化所得的溶液时，如残留过氧化氢，小柱中会分解产生气泡，使溶液流出不一致。此时，加压吸引强制流出。

 

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